我回頭看你的文章, 總覺得推文裡的人講的跟你在講的好像沒什麼交集
你在養的是ES cell, (human或是mouse?)基本上是養在feeder上的
但不是永遠都是如此, 也是有feeder free的養法
一般來說passage ES或iPS有兩種作法:
一種是enzymatic passage, 用dispase或其他collagenase類的agent
讓"一團一團細胞"浮起來還是盡可能是一團
這是因為stem cell很容易死 在維持colony狀況下會提高viability
另一種作法是用任何mechanical dissociation, 用pipette tip或用燒尖的玻璃管
(glass pipette拿去燒把前端燒的很尖)都是常見的作法
這原則也是一樣,要盡量讓細胞維持colony
從你文章裡似乎你老闆要你練習passage
那拿ES cell就是有違本意了
human ES cell的passage時間大約是一週上下, 但前提是你每次passage時維持colony
因為約一週後colony就會變大,大到中間開始differentiate,
所以你一定是要在顯微鏡下用器具"挑"掉differentiate的區塊,
然後維持colony的型式passage
如果你要把ES cell打成single cell而非colony,
也不是不行, 但從一個單獨的cell要長到可以passage的大小大約是3-4週
(也就是yamanaka的reprogramming所需要的時間. 我自己的project則是作gene targeting
也是把iPS dissociate成單一細胞然後長成colony也是需要約3週)
所以用ES cell練習single cell dissociate passaging蠻奇怪的
如果你一定要這麼作, 我的建議:
-用accutase, 不要用trypsin, 加入5分鐘後用P1000沖幾下colony, 就會變成single cell
-離心不要離太久也不要用太高轉速. 1000rpm 4-5分鐘就夠了.
在作ES/iPS cells時都是盡可能的減少大量操弄以維持viability
至於你所謂的團塊, 如果是肉眼所看的到的團塊,
那並不是feeder (feeder的數量遠少於你well裡的stem cell)
而是你離心離太久或太快, 細胞很緊密的集成團.
即使是HEK, 你如果離心太久, 也很可能發生團塊的現象
如果是HEK這種細胞, 我們通常是用10ml pipette把整個細胞液吸起,
接著把pipette抵在well的底部平面,
然後用力push. 用pipette和well之間的微小縫隙讓細胞變成single cell跑出來
但這是用在HEK這種頑強,怎麼作都死不了的細胞,
對stem cell這種一不爽就死給你看的細胞就不太建議這樣作.
以上希望對你有幫助. 還是先確定你要學的是什麼,
是一般passage的技巧,還是stem cell passage的技巧?
如果是前者, 去要個HEK之類很好養的細胞才是王道, 用stem cell來練習太奇怪了
※ 引述《jkq (玩具)》之銘言：
: 標題: [求救]請問繼代細胞方法
: 時間: Wed Sep 18 14:25:20 2013
: :
: 想請問大家 繼代細胞時 有遇過重新回溶細胞 有打不散的情形嗎:
: 目前養的是 embryonic stem cell 所以下面有層feeder
: 用trypsin 作用4分鐘 之後 中和 離心 重新用medium回溶
: 但是 光用塑膠pipette 回溶 是沒辦法完全回溶
: 就還是有些細胞團塊 打不散 在懷疑是不是feeder也跟著起來
: 但是dish的feeder都還在
: 也試過將團塊沉澱下來 但這樣細胞量 真的不太準
: 想請問看看 是否還有其他方式 可以打散團塊
: --
: ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
: ◆ From: 140.128.67.246
: 推 zoom8080:Trypsin完後先用巴斯德管打一下在加medium中和試試看 09/18 17:29
: 推 aceliang:我以為ESC都是用scratch養 = =a 09/18 19:34
: 推 yuasa:加少量medium (1 cc),用1 cc Pipette打散 09/18 19:40
: 推 qiet:用2cc serological pipette 將細胞團塊刮下 09/18 19:50
: 可以用刮的喔
: → qiet:繼代培養ES cell應該不建議將細胞將細胞打散成single cell吧? 09/18 19:51
: 的確不能打成single 但剛開始練習 老闆說先把大團的打小 single也沒關係
: 推 leoblack:將trypsin離心去掉上清液後~先敲敲管子或刮刮racker~ 09/18 19:57
: ※ 編輯: jkq 來自: 114.46.156.131 (09/18 20:36)
: ※ 編輯: jkq 來自: 114.46.156.131 (09/18 20:38)
: 推 ljii:stem cell不就是要一團一團的passage嗎???@@ 09/19 16:05
: → ljii:要練習拿HEK練習最好 09/19 16:06
: 一團一團是沒錯 但會變的大小不一 pa的時間點就難抓
: ※ 編輯: jkq 來自: 221.120.65.20 (09/19 21:14)
: 推 marvelous13:ES要用割的！ 09/20 22:05
: 推 conective:繼代就不是single cell的方式 練習打成single cell的目 09/20 22:31
: → conective:的是？ 你應該是練習打成小團就可以了 09/20 22:31
: → conective:而且用塑膠pipette打不散是正常的吧 09/20 22:33
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