[求救] WB的band不平

看板Biotech作者 (夢與天空交織的瞬間)時間11年前 (2013/05/28 23:38), 編輯推噓0(0推 0噓 8→)
留言8則, 2人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
請教各位板友前輩 我最近在做Co-IP，先用100ul的protein A sepharose beads與1ug的抗體做conjugation 之後再去抓protein，之後用等體積的2x sample buffer配成sample 但是跑完WB的時候去照膠發現band都不水平... 我有把體積調成等量了 sample煮完之後也利用離心把beads盡量去除了 (我會把sample先離心，把液體吸至新的tube在離心一次，然後只有取40ul*2次出來load gel，且都從液面開始吸) 但為什麼我WB的band都會歪歪斜斜的不在同一條水平線上呢>"< 是不是跟transfer也有關係呢? 我把gel放到membrane(NC)上時會用滾輪趕泡泡，這樣會造成影響嗎? 我們是用Bio-Rad的transfer machine ( http://ppt.cc/IGQ9 ) 由於要看的蛋白很大，Transfer時間較長，有時候gel會燒焦，這也會影響嗎@@? 謝謝大家~煩請解惑<(_"_)> -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 111.250.122.24
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05/29 00:38, , 1F
Western blot 的結果圖呢？有圖片比較好判斷問題點。
05/29 00:38, 1F
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05/29 00:39, , 2F
不過你說的歪歪斜斜，是每一條 band 個別都歪歪斜斜，
05/29 00:39, 2F
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05/29 00:39, , 3F
還是所有的 band 連成一條斜線或有弧度的線？
05/29 00:39, 3F
圖要等我下班才方便放上來，我晚點放，謝謝您^^ Sorry~昨天太忙，今天附上圖片 http://ppt.cc/6Bd- 謝謝~
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05/29 02:52, , 4F
假設你用這台,用他整套transfer耗材,那張gel很容易變形就會
05/29 02:52, 4F
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05/29 02:53, , 5F
歪斜,可是你說會燒焦,推測你用自家耗材,你的蛋白應該過的不
05/29 02:53, 5F
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05/29 02:54, , 6F
完全,當然,會變形也跟為了跑大蛋白才用低％的gel有關
05/29 02:54, 6F
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05/29 02:55, , 7F
不過你應該也會在WCE看到不平整現象,不只是IP-martics
05/29 02:55, 7F
後來想想應該不是這個問題，因為跑一般WB不會這樣，還是謝謝您^^ ※ 編輯: lxz 來自: 111.250.122.24 (05/29 08:21) ※ 編輯: lxz 來自: 111.250.101.97 (05/30 23:36)
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05/30 23:53, , 8F
看起來是％相關阿,而且每個well的PSB濃度不一樣加重了
05/30 23:53, 8F
這麼嚴重的歪斜確實只出現在低%的Gel，在sample buffer的部分也不一樣 input(左)及PC(右)都是加5x sample buffer去配，但beads pellet是用2xSB，且來源不同 跟同學討論的結果可能是鹽類濃度不一造成 ※ 編輯: lxz 來自: 111.250.101.97 (05/31 08:20)
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