[求救] western plasma membrane壓片雜點

看板Biotech作者 (聽，是誰在唱歌)時間11年前 (2013/05/11 15:22), 編輯推噓0(0推 0噓 10→)
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最近在壓Plasma membrane上的蛋白質，利用不同NP-40濃度的分離protocol。 但跑完照UVP後，發現在目標蛋白質大小的部份(48-63kd)，會有莫名其妙的雜點。 如圖: https://www.dropbox.com/s/me5f16hp1r2mqif/sdf.jpg
而internal control的部份(9x kd 以上)背景則是相當乾淨。 當初懷疑可能是一抗或是blocking suloution(5% milk powder)的關係， 但昨天用了一般WB的萃取total protein去壓目標蛋白質，卻沒有這樣的問題。 懷疑會是在分離膜蛋白質時用了NP-40的關係(0.1% -> Free -> 1%)， 實驗室的NP-40放在離心管應該有個一兩年以上了，不確定會不會是這個因素， 但在Internal control的部份90kd以上，又不會有這些雜訊。 不知道有沒有哪位前輩可以救命，感謝! -- 所有物理定律都不是百分之百正確， 當然，更不是真理。 物理定律只是反映出，人類企圖定量的暸解物質宇宙過程中， 所給出的數學模型。 就像牛頓運動定律是不正確， 牛頓萬有引力定律也不太正確， < 聯立 > 但這並無損它們在人類探索自然定律過程中的地位，它們具有永恆的價值。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.98.191 ※ 編輯: qqmango 來自: 140.112.98.191 (05/11 15:23) ※ 編輯: qqmango 來自: 140.112.98.191 (05/11 15:23)
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05/11 16:11, , 1F
很像一抗的問題,放太久,有沉澱,未spin等,尤其是放冷藏的
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05/11 18:08, , 2F
有些一抗你泡在牛奶裡會這樣，可以改成泡在 1% BSA中試試
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05/11 18:09, , 3F
同一片SAMPLE其他蛋白都沒問題，我不會先去懷疑蛋白有問題
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05/11 18:53, , 4F
一抗是在5% BSA中壓o/n，因為一般抽的話壓起來都ok，但用
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05/11 18:53, , 5F
膜蛋白分離protocol才會出現，所以不知道是什麼狀況
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05/12 23:19, , 6F
牛奶沒有完全溶解也會造成這種現象
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05/13 00:08, , 7F
因為同一片都是用同樣的blocking sol.，有可能會因為抗體
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的關係而有差異嗎?
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但是若是壓Whole cell lysate又很正常，可能會是什麼因素
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05/13 00:09, , 10F
呢?
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文章代碼(AID): #1HZV780j (Biotech)
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