[求救] 關於western blot transfer的問題

看板Biotech作者 (Ben)時間11年前 (2013/03/30 15:59), 編輯推噓11(11推 0噓 16→)
留言27則, 17人參與, 最新討論串1/1
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出 以方便板友幫您追蹤問題 ----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章---- 請問一下 現在有在做western blot 最終顯影的結果會有一片疑似泡泡的東西(但感覺不太像) 而且常常發生 如下網址↓↓↓↓ http://ppt.cc/JzU_ 而我認為是transfer的問題 因為每次transfer完後用Ponceau S染色就會看到那一片 奇怪的是 實驗室的學姊她做都不會發生這種事情 所有儀器、試劑都是用一樣的東西 難道是我本身的手法有問題嗎? transfer條件為(溼式, 400 mA, 1小時) 拜託各位高手 我已經困擾很久了 謝謝 剛剛transfer完染完Ponceau S又悲劇了→ http://ppt.cc/0nN0 我確定membrane和gel絕對沒有氣泡 我有多加一片海綿夾緊了還是這個樣子 不知道這是怎麼回事 唉~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.128.63.180
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03/30 17:02, , 1F
感覺是有東西擋道顯影或者是transfer
03/30 17:02, 1F
推
03/30 17:55, , 2F
membrane與gel之間的氣泡有趕乾淨嗎??
03/30 17:55, 2F
推
03/30 18:18, , 3F
像氣泡
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03/30 18:19, , 4F
transfer氣泡沒趕乾淨，ECL上不均勻都有可能
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03/30 18:36, , 5F
照你描述應該就是transfer時gel跟menbrane中間有氣泡
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03/31 01:35, , 6F
看起來不像泡泡 海綿用很久了嗎? 多加一片 這樣會夾緊一點
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推
03/31 03:00, , 7F
應該是那個位置有一大團protein，反而起了blocking之效
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03/31 03:01, , 8F
大大你若對照一下你的CBR圖(如果有)可能可以看出線索
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沒有做CBR的話membrane照完再泡CBR染也是可以~
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03/31 03:18, , 10F
都已經染了Ponceau S了還CBR
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我確定membrane和gel之間的氣泡有趕乾淨，我有在猜想是不是將圖畫紙放在membrane上 後又產生氣泡，但是我無法看到氣泡(我還是有做趕氣泡的動作)，請問這該如何改善? 小弟我本來認為是membrane有沾到什麼東西導致那一個區域無法transfer至membrane上。 to alulu:海綿用很久了，我會照你方法再試試 謝謝各位 ※ 編輯: ben00691206 來自: 122.117.13.40 (03/31 08:41) ※ 編輯: ben00691206 來自: 122.117.13.40 (03/31 08:42) ※ 編輯: ben00691206 來自: 122.117.13.40 (03/31 08:44)
推
03/31 16:36, , 11F
放上圖畫紙後 我們前會用尺或者小滾輪來回滾 去除氣泡
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※ 編輯: ben00691206 來自: 140.128.63.180 (03/31 20:53)
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04/01 13:31, , 12F
transfer溫度呢? buffer濃度呢? buffer有均勻嗎?
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04/01 13:32, , 13F
建議妳跟著學姊從頭到尾做一遍看看,哪些地方手法不同?
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04/01 20:18, , 14F
建議直接求學姊看你作 會比你看學姊作來得容易抓錯
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推
04/01 23:05, , 15F
想借問一下..我們的圖畫紙用久就很容易卡泡泡.大家也
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04/01 23:05, , 16F
是這樣嗎?會大概重複用幾次呢?
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推
04/02 12:05, , 17F
圖畫紙我沒有在reuse的~
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04/02 17:17, , 18F
1.membrane染染看是不是真的有一團，如果沒有
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2.可能是加ECL時membrane上有泡泡，可以吸乾membrane再加
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推
04/04 19:40, , 20F
就是泡泡沒趕乾淨阿 如果你說你很確定沒氣泡 我想你要
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改變你確定的方式
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推
04/06 13:58, , 22F
你可以拿個塑膠管(吸管之類的)，滾壓在膠上，這樣很有效
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推
04/09 01:15, , 23F
請問原波一個基本但有點蠢的問題 你趕氣泡是泡在TRANSFER
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04/09 01:16, , 24F
buffer裡面趕 還是放在空氣裡面貼上濾紙之後趕??
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推
04/12 15:40, , 25F
membrane戳到也會這樣
04/12 15:40, 25F
推
04/20 13:05, , 26F
我了解你的痛,我8年助理&PHD跑了近千片膠, 這應該是transfer
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04/20 13:07, , 27F
問題,我建議fully pre-soak海綿和filter paper杜絕氣泡 加油
04/20 13:07, 27F
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