[求救]關於Cloning construct的困難...

看板Biotech作者 (小海豚)時間13年前 (2012/10/06 22:12), 編輯推噓10(10推 0噓 27→)
留言37則, 10人參與, 最新討論串1/1
各位大大> < 想要向各位求助一下 我現在在做cloning， 問題有以下： 1.digest完後gel extraction濃度超低，都不會超過20ng/uL..... 2.學姊說，儘管我切膠萃取濃度只有19.3ng/uL(我回溶40uL)， 但是vector這樣的濃度已經夠了，然後我的insert是我自己設計的 primer linker(total只有45bp)。既然學姊說vector夠了，我就直 接做下去了，做到ligation，做了n次，試了不同比例都無法成功， 學姊們說，linker的ligation要1:30~1:50....且做ligation時linker 就當作100bp去做計算。 我的vector是7.6kb濃度只有19.3ng/uL，linker是45bp(當作100bp計算), 濃度有320ng/uL(這是做過annealing後的濃度)，如果照學姊們說的比例 (1:30~1:50)這樣linker量要加超多!!!然後我們實驗室是用ligation high， 要和sample 1:1混和，這樣ligation的總體積就超多= = 然後，之後transform加入菌液的體積就要更多，重點是，塗完plate之後， overnight每次都是空空如也T^T.....做好幾次都這樣，有沒有人可以提供點意見? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 1.162.7.76
推
10/06 23:11, , 1F
首先 你digest的時候用多少vector下去切?
10/06 23:11, 1F
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10/06 23:12, , 2F
再來 重新檢查insert是否有問題(保險起見)
10/06 23:12, 2F
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10/06 23:13, , 3F
然後 那個比例是什麼比例? 是莫耳數比 還是濃度比?
10/06 23:13, 3F
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10/06 23:14, , 4F
最後可以換其他ligase做看看
10/06 23:14, 4F
推
10/06 23:33, , 5F
linker有PNK嗎
10/06 23:33, 5F
推
10/06 23:49, , 6F
那vector就拿多一點去切阿... 也花不了你多少時間
10/06 23:49, 6F
推
10/06 23:49, , 7F
我還曾經濃度低到測不出來 硬著頭皮做 最後有成功喔
10/06 23:49, 7F
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10/06 23:49, , 8F
ligation挑菌做N次不是更浪費時間
10/06 23:49, 8F
推
10/06 23:54, , 9F
如果怕gel extraction做不好 試試直接過column或沉澱啦
10/06 23:54, 9F
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10/07 00:08, , 10F
依照你的數字怎麼算都是linker要加超少量,至少要再稀釋10倍
10/07 00:08, 10F
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10/07 10:35, , 11F
因為實驗室學姊們都說回收率低，甚至都要下到10~20ul
10/07 10:35, 11F
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10/07 10:36, , 12F
學姊們幾乎回收率都很低，所以vector幾乎要下到10~20
10/07 10:36, 12F
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10/07 10:38, , 13F
至於比例呢，是用[vector]x7.6x量:[linker]x0.1x量
10/07 10:38, 13F
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10/07 10:40, , 14F
照這樣算linker要加超多吧@@
10/07 10:40, 14F
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10/07 10:41, , 15F
vector當然可以多切一點....只是我想找出原因...不然
10/07 10:41, 15F
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10/07 10:41, , 16F
會越下越多...我之前有在不同實驗室做過cloning，
10/07 10:41, 16F
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10/07 10:42, , 17F
vector頂多下個3~5ug就夠了，因為回收率夠高
10/07 10:42, 17F
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10/07 10:43, , 18F
不過之前不是自己設計的linker，而是另外一個切下來
10/07 10:43, 18F
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10/07 10:44, , 19F
的insert，在這實驗室所設計的linker是很多切位合起
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10/07 10:44, , 20F
來的，以利後續的步驟。
10/07 10:44, 20F
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10/07 10:45, , 21F
是ligation做n次，根本沒辦法挑菌，因為根本沒長= =
10/07 10:45, 21F
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10/07 10:49, , 22F
老闆也叫我直接沉澱直接ligation，但是我覺得不可能.
10/07 10:49, 22F
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10/07 10:50, , 23F
因為我digest完不要的那一段有2kb多，可是我要接進去
10/07 10:50, 23F
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10/07 10:51, , 24F
的linker只有45bp，這樣直接沉澱ligate太危險了
10/07 10:51, 24F
推
10/07 12:11, , 25F
比例是[vector]x量/7.6:[linker]x量/0.1吧?
10/07 12:11, 25F
推
10/07 12:14, , 26F
照你那樣算當然體積會超大
10/07 12:14, 26F
推
10/07 13:33, , 27F
用除的啦 你加這麼多搞不好通通自接去了....
10/07 13:33, 27F
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10/07 14:53, , 28F
vector只要切0.5~1ug就很夠做了,多切只會造成越多切不乾淨
10/07 14:53, 28F
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10/07 14:57, , 29F
濃度20ng/ul很夠了,會做不出來是其他的問題
10/07 14:57, 29F
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10/08 00:37, , 30F
ㄜ...為什麼之前的實驗室試教我用乘的呢@@
10/08 00:37, 30F
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10/08 15:50, , 31F
1.你記錯 2.他們教錯
10/08 15:50, 31F
推
10/08 17:22, , 32F
那個比例是莫耳數比 不要只記算式~
10/08 17:22, 32F
推
10/08 20:47, , 33F
insert短 所以量少但是莫耳數高
10/08 20:47, 33F
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10/11 23:25, , 34F
是莫耳數比 所以計算時會出現倒數...但是你要去記意義比較好
10/11 23:25, 34F
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10/14 22:47, , 35F
你的算法根本錯誤，你的insert稀釋10倍來用都還嫌太濃
10/14 22:47, 35F
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10/14 22:50, , 36F
回去重念高中化學再來做實驗
10/14 22:50, 36F
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10/14 22:53, , 37F
^國中
10/14 22:53, 37F
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