[求救] RNA pellet的回溶

看板Biotech作者 (valine)時間12年前 (2012/06/16 19:11), 編輯推噓7(7推 0噓 15→)
留言22則, 11人參與, 最新討論串2/2 (看更多)
連續三次RNA濃度都過低(0.1 ug/ul以下)，完全無法轉DNA 以下是我的操作步驟，請大家看看是否有問題，謝謝 1.細胞數量：12 well，50000 cells/well，長7天　（之前也是這個細胞數，抽得出來） 2.TRIzol 400 ul/well，傾斜刮細胞，在顯微鏡下確認細胞已被刮除 3.收集至eppendorf，加chloroform 80 ul，混合均勻靜置2分鐘，12000xg離心15分鐘 4.取上清液170 ul，加isopropanol 200 ul，混合均勻靜置10分鐘，12000xg離心10分鐘 5.倒去上清液，看得到pellet，加75% EtOH in DEPC H2O 1 ml，7500 xg離心5分鐘 6.倒去上清液，看得到pellet，倒置於laminar flow烘乾，確認pellet在管底沒漂走 (自從第一次做RNA extraction發現有有機溶劑汙染後，我都烘乾1 h，確保EtOH沒殘留) 7.看得到管底有一圈，pellet本身變透明，加15 ul DEPC H2O，靜置5分鐘 8.緩慢pipet 5下，spin down，靜置5分鐘，取2 ul以Nano Vue測濃度 曾想過是否是pellet太乾無法回溶，雖然之前我也是烘乾1 h， 拿三天前也是濃度太低的RNA做測試（保存在-70度。三天總該回溶了吧？）， 結果濃度和三天前差不多T^T -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 210.60.122.200
推
06/16 20:19, , 1F
一小時太久了吧 囧 可以用tip吸乾放個10-15分就差不多了
06/16 20:19, 1F
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06/16 20:20, , 2F
不然也可以稍微加熱一下 應該是乾到溶不掉了...
06/16 20:20, 2F
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06/16 21:12, , 3F
應該不太可能乾到溶不掉,有時候忙都放好幾天才回溶
06/16 21:12, 3F
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06/16 21:12, , 4F
也是OK的
06/16 21:12, 4F
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06/17 00:28, , 5F
RNA乾太久好像會無法回溶耶
06/17 00:28, 5F
推
06/17 01:31, , 6F
加熱55-60 10min回溶
06/17 01:31, 6F
推
06/17 01:46, , 7F
所以之前有成功過囉？做法上有什麼改變？
06/17 01:46, 7F
推
06/17 12:32, , 8F
加熱回溶試試看
06/17 12:32, 8F
加熱回溶會不會破壞RNA呢? 因為我連vortex都害怕會讓它斷掉
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06/17 15:28, , 9F
qqmango:加熱55-60 10min回溶，我也都是這麼溶的:)
06/17 15:28, 9F
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06/17 15:28, , 10F
啊不對，我是用65度 xD
06/17 15:28, 10F
推
06/17 15:47, , 11F
單純加熱跟vortex應該不會斷掉啦
06/17 15:47, 11F
推
06/17 22:13, , 12F
Trizol的protocol就有55-60度回溶步驟啊 尤其乾一小時應該
06/17 22:13, 12F
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06/17 22:14, , 13F
不好溶 有機溶劑對你後續實驗影響大嗎?
06/17 22:14, 13F
據說Q-PCR machine會自動終止（雖然我沒經歷過）
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06/18 11:11, , 14F
不然去借抽氣機？通常都蠻快就可以抽乾了喔~
06/18 11:11, 14F
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06/18 11:14, , 15F
之前回收量最高可以到多少呢?
06/18 11:14, 15F
只要有0.1 ug/ul以上就可以轉cDNA了，最高有0.2 ug/ul左右吧
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06/18 12:45, , 16F
我記得trizol protocol都有叫你不要晾乾到透明了
06/18 12:45, 16F
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06/18 23:11, , 17F
RNA vortex不太會斷，畢竟不像是genomic DNA那種大分子
06/18 23:11, 17F
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06/23 03:03, , 18F
1小時太久 基本上變透明就算是沒救了 DNA RNA都一樣
06/23 03:03, 18F
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06/23 03:03, , 19F
一點點酒精殘留也不會怎樣
06/23 03:03, 19F
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06/23 03:04, , 20F
你可以把EtOH倒掉以後 spin 5sec 再用tip把剩下的EtOH吸掉
06/23 03:04, 20F
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06/23 03:04, , 21F
風乾1分鐘
06/23 03:04, 21F
好，我會試試，謝謝大家 ※ 編輯: tempsperdu 來自: 60.251.101.158 (06/23 12:49)
推
07/09 22:34, , 22F
RNA extraction 沒有加熱的步驟?
07/09 22:34, 22F
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