[求救]土法煉鋼做Site-Directed Mutagenesis !

看板Biotech作者 (Wengda)時間13年前 (2012/06/05 14:58), 編輯推噓11(11推 0噓 16→)
留言27則, 10人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
教授不給我買kit T.T 只好拿實驗室有的東西來Try Try 看 ~ Polymerase 方面的問題 : 一般的Taq - 會在尾端多加一個A 好像不能用 而且會產生更多突變 ! NEB Phusion High-Fidelity DNA Polymerase - 這個可以用嗎 ? 我很怕他會把single-strand primer 切掉 ~ 我有上它網站查 只有寫說 會產生 Blunt-ended product ! 也俱有3’→ 5’ exonuclease 活性 ! 但沒有寫到會不會把Primer切掉 ~ Pfu Turbo High-Fidelity DNA Polymerase - 想買這個來用 ~ kit 也用這種的 ~ 具有上述的優點 !! 所以想知道 NEB的那株Polymerase能不能拿來用 !! DpnI方面 - 不一定要用吧 ?? 可能就麻煩多定序幾顆 ? 是這樣嗎 ? 還是大大在做的時候還是會習慣 要加入這個步驟 比較省事 !!?? Competent cell - 實驗室只有DH5alpa DH5alpa 是否也具有將 nicks 修補的功能 !! 煩請熟練的大大分享一下心得 ~ 感謝 !! -- 我愛妳 用生命的愛 ~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 203.64.80.73
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06/05 15:18, , 1F
Pru?? DapI?? 你要不要把錯字改一改orz
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※ 編輯: mkmai0802 來自: 203.64.80.73 (06/05 15:27)
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哈哈 打錯了 抱歉 ~ 忘了檢查 >< !
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阿這位大大可以幫我解答嗎 感謝 XD
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基本上我都是用pfu這個polymer做 然後做完一定要用DpnI切
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不然保證你做出來都是沒變過去的 DH5alpha就ok了 只是我
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是用commercial的 效率會比較高
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基本上protocol可以參考QuikChange Site-Directed
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Mutagenesis Kit的份去做 成功率滿高的
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我是下10~50ng的template，然後用互補的primers P一圈
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plasmid，25個cycles後用DpnI切，切完就照一般的transform
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步驟做，然後我也是用自己做的DH5a competent cell.
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p.s. 我是用Fermentas的polymerase和digestion enzyme
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用過pfu和KOD 成功率很高 不過extension時間要久一點
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要比廠商建議的時間多一倍
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我也是用QuikChange protocol
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pfu跟phusion都可以~ 其實kit也只有polymerase跟DpnI吧XD
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買零件比較划算，實驗室有現成的都可以用，kit指是把method
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會用到的賣給你而已，跟成功最相關的primer也是自己設計的
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根本不需要kit阿...你只需要厲害的pfu跟磷酸化的primer
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Phusion很貴耶 查一查舊文就知道怎麼做的
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先想好primer怎麼設計吧
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quick change買pfu跟DpnI就好啦 買kit很浪費吧
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dh5a就夠用了
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1. 我以前就是用phusion在做site directed
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2. 買 DpnI + Primer設計的溫度參考 invitrogen kit的
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protocol (網站應該可以download吧!!) 就可以很順利
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以前買一組kit好像是兩萬多吧...(學姊買的不是我..)
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文章代碼(AID): #1FpQuIl3 (Biotech)
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