[求救] RT-PCR出不來

看板Biotech作者 (阿水)時間13年前 (2012/05/29 11:20), 編輯推噓3(3推 0噓 9→)
留言12則, 3人參與, 最新討論串2/2 (看更多)
請問板上各位強者 因為小弟現在開始碰到要抽取大鼠spinal cord組織mRNA的實驗 使用的是Q牌的kit(好貴...) 但是抽出來的RNA濃度大約只有100~200ng/ul(好少...) 而且在做RT-PCR的結果中 不論哪次抽的組織 TNF-a(40cycle) IL-1b(35cycle) GAPDH(25cycle)都可以順利P出來 但是IL-6卻是只有第一次抽的組織P的出來(primer沒問題) 之後抽的組織跑出來都空空如也(但是TNF-a IL-1b GAPDH都正常) 而且IL-6都發神經跑到60cycle...還是空的 實驗步驟如下: 組織取下來放到RNA later保存4度C overnight 隔天取出來放入RLT buffer中以Microson的sonicator打破組織至無塊狀 之後離心並加入70%EtOH 再來就是讓RNA binding在Kit附的膜上進行一連串的wash 最後用50ul RNase free water elute RT轉1.5ugRNA PCR時取4.5ul的RT sample(總體積50ul) 以上全部都大手筆買Q牌的kit... 但還是卡在IL-6無法正常P出來的狀況 如果RNA被震斷裂 那GAPDH還跑得出來...? 但是通常作一組實驗(無加藥老鼠組 加藥老鼠組 無加藥治療老鼠組 加藥+治療老鼠組) 共4個spinal cord sample卻會出現只有某一組IL-6可以PCR出來，其他組都不行... 但是mRNA都是同時抽 同時轉RT 同時PCR... 感謝各位看完這麼冗長的實驗經過 也請給些意見 感謝! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 210.60.122.10
推
05/29 14:31, , 1F
pipetman污染 拆開來清洗+滅菌以後應該會全都p不出來
05/29 14:31, 1F
推
05/29 15:03, , 2F
control的功能就是告訴你rna is fine.. primer換過吧
05/29 15:03, 2F
推
05/31 22:24, , 3F
有一種東西叫filter tip~~然後勒 某些品牌會告訴你
05/31 22:24, 3F
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05/31 22:26, , 4F
filter的作用是保護你的pipet不會爆衝 但是正確的品牌
05/31 22:26, 4F
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05/31 22:26, , 5F
會告訴你 filter的意義在於防止上下端gas層的交互汙染
05/31 22:26, 5F
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05/31 22:28, , 6F
所以 選用正確的filter tip可以避免你的pipet汙染問題
05/31 22:28, 6F
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05/31 22:29, , 7F
另外某些pipet會告訴你整支可以拿去菌 請不要再相信拔
05/31 22:29, 7F
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05/31 22:29, , 8F
獅子鬆毛可以...的傳說了 pipet上端的機心不能拿去滅菌
05/31 22:29, 8F
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05/31 22:30, , 9F
原因在於 機心內有機械的連機點 還有螺絲等各種構造
05/31 22:30, 9F
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05/31 22:31, , 10F
在高壓高溫下 每個部見的膨脹系數都會不同 然後冷卻
05/31 22:31, 10F
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05/31 22:31, , 11F
時冷縮的係數也有差 因此整支拿去滅只會讓你的pipet提
05/31 22:31, 11F
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05/31 22:32, , 12F
前壽終正寢 除機心之外的部分則是可以拆下後滅菌的
05/31 22:32, 12F
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文章代碼(AID): #1Fn41dNw (Biotech)
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