※ 引述《ab15920 (癮)》之銘言：
: 請問大家~
: 我的蛋白質是一種cytokine
: 很小(8~14 kd)且量也很少
其實這樣的分子量不算很小。
: 我用western 來做…..都壓不到band
: 另外有用ELISA測過，量大約為5000 pg/ml (這是我有overexpression後的)
: 請問一下~
: Western 是因為量太少，所以才壓不出來嗎?
: 還是western 方面上有哪些地方需要注意的
你可以試試看濃縮。
取 30 kD ultrafiltration 的透過液（分子量小於 30 kD）
再用 3 kD ultrafiltration 濃縮。
或許你就可以壓到。
如果你希望保留你的 positive control 在同一個 fraction 中，
可以調整 ultrafiltration 的 cut-off molecular weight。
還有另外一種方式，就是增加偵測敏感度。
像是用 isotope labeling。
: 再來就是，
: ELISA的結果可以取代western的結果嗎? (因為我想都是測protein表現量)
ELISA 跟 western 是不一樣的實驗。
ELISA 是全盲，吸光告訴你蛋白質量有多少就多少。
但是 sample quality，non-specific Ab-Ag interaction 都有可能影響 ELISA。
當然，ELISA 是個相當方便的方法，
如果你的抗體是商品化的試劑組，
而且操作手冊上載明你用的 cell type 沒有非專一性反應，
那或許可以就用 ELISA 來同時定量跟定性。
（很多實驗室還是會希望有 Western blot 的圖）
但如果是 heterologous expression，那就不要完全相信 ELISA 結果。
: 麻煩大家幫我解決這困擾很久的問題嚕~
: 非常感激
如果你不想要進行 ultrafiltration，
但是你還是想知道你的 ELISA 是不是夠專一性的話，
也可以拿 ELISA 的 monoclonal antibody 進行 immunoprecipitation，
然後跑 SDS-PAGE 染銀染或是再壓 Western。
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推
10/15 08:23, , 1F
10/15 08:23, 1F
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