[求救] western blot問題

看板Biotech作者 (Sharon)時間12年前 (2011/09/29 19:20), 編輯推噓10(10推 0噓 25→)
留言35則, 17人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
最近做western blot一直做不出來，做得很挫折 T^T 雖然之前也在板上爬過不少有關western blot的文 也試過不少方法 不過每次壓出來還是一片白..... 希望版上大家可以幫我看看我的步驟上有沒有哪邊需要改的 謝謝大家 <(_ _)> --------------------以上是前言分隔線XD----------------------------------- 我要跑的蛋白質主要分子量分布為40-180kDa separating gel用12% transfer membrane 是PVDF transfer步驟: 1.transfer 16V 1hr 4℃ 2.blocking 1hr (5% non-fat milk in PBS) 3.一抗 4℃ O/N (稀釋1:1000-1:5000，主要以說明書為主) 4.wash 10 min x 3次 5.二抗 RT 1hr (稀釋1:1000-1:5000，主要以說明書為主) 6.同4 7.ECL作用數秒~3min後壓片 二抗的部分有洗過1hr.2hr.3hr 但是都沒有壓出來 壓片的問題大部分是壓不出來 不過也有遇過幾次黑片的狀況 抗體廠牌... 一抗大部分是R&D system，少部分是santa cruz 二抗是santa cruz (之前爬文santa的抗體好像有點 恩...Orz) 另外，想順便問一下 Ponceau S有沒有哪一家比較便宜阿... 之前問sigma的好貴又好大罐 = = " 謝謝大家 >"< -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.130.93.48
→
09/29 19:48, , 1F
請問是連internal ctrl壓不出來嗎？ 如果是 ECL check 一下
09/29 19:48, 1F
→
09/29 20:52, , 2F
先確定internal control可不可以做出來
09/29 20:52, 2F
→
09/29 21:20, , 3F
感覺是沒轉印過去
09/29 21:20, 3F
推
09/29 21:42, , 4F
抗體表示:
09/29 21:42, 4F
→
09/29 22:36, , 5F
感覺沒轉過去+1 可以染看看轉完的gel看殘留量
09/29 22:36, 5F
→
09/29 22:44, , 6F
marker有過嗎? 180kd不是太好transfer 我也覺得是tran的問題
09/29 22:44, 6F
→
09/29 22:44, , 7F
你用哪一種transfer semi-dry還是濕式
09/29 22:44, 7F
→
09/29 22:45, , 8F
ECL不用放那麼久
09/29 22:45, 8F
→
09/29 22:46, , 9F
二抗 太濃 1:6000起跳
09/29 22:46, 9F
→
09/29 23:30, , 10F
忘了打上去....是用濕式的
09/29 23:30, 10F
→
09/29 23:31, , 11F
目前的狀況是連internal ctrl壓不出來~>"<~ 也有考慮到是否
09/29 23:31, 11F
→
09/29 23:32, , 12F
沒轉過去，但是一樣的條件之前也是有壓成功過@@
09/29 23:32, 12F
→
09/29 23:37, , 13F
轉完的gel也有染過，gel下半部有變淡或是消失，所以應該有
09/29 23:37, 13F
→
09/29 23:37, , 14F
轉過去....
09/29 23:37, 14F
→
09/30 08:06, , 15F
如果濕式用這樣的條件應該不夠....或是蛋白量的問題
09/30 08:06, 15F
推
09/30 08:44, , 16F
同意樓上,溼式100V 60min或400ma 90~120min.為甚麼16v??
09/30 08:44, 16F
→
09/30 08:48, , 17F
ECL做用時間,加到memebrane後,在暗房看不到螢光 可試5~30
09/30 08:48, 17F
→
09/30 08:48, , 18F
min
09/30 08:48, 18F
→
09/30 08:51, , 19F
PVDF 有按照說明書處理嗎?ponceau s 個人覺得沒甚麼用處
09/30 08:51, 19F
→
09/30 09:36, , 20F
40-180 為甚麼不用8%就好??
09/30 09:36, 20F
→
09/30 10:02, , 21F
PVDF 染不上ponceau s ＝＝有沒有tran 完的圖？
09/30 10:02, 21F
→
09/30 10:47, , 22F
我覺得應該用6% gel 壓片沒有bands應該 壓幾小時才算數
09/30 10:47, 22F
→
09/30 10:48, , 23F
看J的描述 問題應該真的是在transfer
09/30 10:48, 23F
→
09/30 10:48, , 24F
tran完應該整片的protein (marker)90%都要過去
09/30 10:48, 24F
感謝大家都熱心幫我找問題 QQ 因為我們家很少在做western (是幾乎沒在做...) 所以很多東西都是別人的，但是好像大家條件都不一樣，所以也搞了很久&很亂 Orz 之所以用16V & 12% gel 就是別家實驗是給的條件 PVDF使用前都有泡過甲醇 蛋白質量是30ug/well，也有試過到60ug/well，但結果一樣白.... 有考慮過是不是沒轉過去，但是每次轉完marker都有過去(沒有全部) 所以protein應該也有過去....(應該吧....= =) 本來懷疑是抗體有問題，所以有跟弘x連絡過 而ponceau s就是他們跟我說的，之所以會想要買也是想確定到底轉的狀況如何 感覺上似乎真的是在transfer的問題...(我好像誤會弘x了<囧>) 我會用K大的條件再試看看 Orz 另外想問gel用多少%到底要怎麼判斷? 我只知道好像分子量越小要用%越高.... 還有gel到底要不要加SDS阿....我看paper有的有加 有的沒加耶@@ (對不起...因為實在太外行了所以問題很多 >"<) ※ 編輯: JaShih 來自: 114.39.28.179 (09/30 11:44)
推
09/30 11:19, , 25F
PVDF染Ponceau S需要染久一點才染得上,且要fresh的才好染
09/30 11:19, 25F
推
09/30 14:48, , 26F
感覺transfer有問題 可以的話拿樣品去別家跑(誤)
09/30 14:48, 26F
推
09/30 15:21, , 27F
http://0rz.tw/XWjsJ protein size跟gel%
09/30 15:21, 27F
推
09/30 16:24, , 28F
一般都會加SDS，特殊狀況才不加
09/30 16:24, 28F
推
10/01 10:48, , 29F
推樓樓上的連結!
10/01 10:48, 29F
推
10/01 12:55, , 30F
16V真的好奇怪...
10/01 12:55, 30F
推
10/04 14:09, , 31F
16V非常可疑 一般我都是定電流 50mA for O/N
10/04 14:09, 31F
→
10/04 14:10, , 32F
200mA for 1~2hr 有時我會用100V跑1hr
10/04 14:10, 32F
→
10/04 14:13, , 33F
重點是 maker 要全部都過去!沒過去代表該kD沒過去
10/04 14:13, 33F
推
10/08 21:32, , 34F
16V好低 我都25V以上 200到400mA 最少30分
10/08 21:32, 34F
→
10/08 21:33, , 35F
gel的%樹好像molecular cloning有得查
10/08 21:33, 35F
‣ 更多 JaShih 的文章
文章代碼(AID): #1EX5I40J (Biotech)
‣ 更多 JaShih 的文章
文章代碼(AID): #1EX5I40J (Biotech)