[求救] Luciferase assay

看板Biotech作者 (rickkao11)時間12年前 (2011/08/23 23:14), 編輯推噓7(7推 0噓 15→)
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使用的是promega的kit 每次加入40ul的substract 和 20ul的sample 在黑色九十六孔盤中讀一秒 可是幾次實驗做下來 每次的結果都不太一樣 有時候多有時候少 在螢光顯微鏡下看trasfection的效率都差不多(用GFP) 請問大家在做luciferase assay時有沒有什麼需要注意的地方 可以降低差異的發生 謝謝!!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.211.200
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08/23 23:20, , 1F
試試Dual luciferase assay , 效率用看的不準~
08/23 23:20, 1F
謝謝，實驗室有試用過這個Kit，可是我們加的東西似乎會影響到另外的那個plasmid 表現，用那個normalize之後數劇就平掉了，所以後來就沒用dual了 後來都只能大約用protein assay來normalized ※ 編輯: rickkao11 來自: 140.112.211.200 (08/23 23:40)
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08/24 02:42, , 2F
應該用白色的阿 黑色會吸光
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08/24 09:03, , 3F
用黑盤背景會低一點，只用protein定量有盲點
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可以的話還是用renilla比較好，平掉就是沒趨勢阿= =
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順便補充，是substrate
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差異的話，關鍵應該是在cell culture的部分
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每次細胞數有差不多嗎 或生長情況差不多
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我是會co-transfect beta-gal做normalization
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08/24 23:17, , 9F
細胞的變數相當的多,光是有沒有均勻的seed就是一門學問
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然後seed細胞後,隔多久時間開始做transfection,這也重要.
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如果要overnight,細胞就開始繁殖,細胞數可能就會不一樣多
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所以有沒有需要做serum starvation也要評估.
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雖然現在的kit大多都說serum不會影響transfection,但依照
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經驗,serum free的transfection效果還是比較好,當然,有
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commercial的OPTI-MEM的話就用.
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然後,也是最重要的一點,就是Luciferase不建議和螢光一起
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送進細胞,我以前曾經這樣做過,但在測量冷光及螢光數值時
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非常困擾,我還要把well中的細胞平均分到白盤&黑盤當中
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測出來變異相當的大. 後來我就改用dual assay了!
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08/24 23:28, , 20F
dual的plasmid比例很重要,千萬別一味的1:1送進細胞,多try
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幾種不同condition 或許plasmid就表現了~
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08/25 17:57, , 22F
謝謝樓上!!!
08/25 17:57, 22F
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