Re: [討論]請問哪個e.coli strain比較不會自己剪切 …
借這個標題問一下，因為我也遇到類似的問題……
我要做一個 14.7 kb 的 construct，insert 就有 10 kb，
而且裡面有非常多個 repeat sequence。
Insert 的來源是跟國外實驗室要來的，他們告訴我，他們都是使用 Stbl2
這種 cell strain 要保存這麼高度 repeat 又大 size 的 plasmid DNA。
然後我要把這段 10 kb 的 insert 剪接到其他的 vector 上，
卻是怎麼做都不成功！Orz
因為我們實驗室只有 DH5α，所以我只能將 ligastion 的產物 transformt 到 DH5α…
而且我也試著在 30℃ 培養。
但是，每次做出來的 construct，在用 RE check 的時候，都發現確實有insert 接
進去，卻都是被剪切過的……Orz 而且大大小小的 size 都有，表示被剪切的情況
還不一……
（而且我是使用抗 Kanamycine 的 vector，雜菌的機率很低……）
請問有沒有人有類似 construct 這麼大尺碼的 DNA，又包含高度 repeat sequence
的經驗呢？除了放在 30℃ 培養，還有沒有其它可以避免它被剪切？
或者，有誰的實驗室有 stbl2 這株 E.coli strain，方便給我2~3管的？
（若有必要，我會請我們老師親自詢問你們老闆的~）
感謝大家。<(_ _)>
※ 引述《hdf87ery (hdf87ery)》之銘言：
: 標題: [討論]請問哪個e.coli strain比較不會自己剪切plasmid?
: 時間: Tue Jun 23 19:27:48 2009
:
: 事情是這樣的
: 我construct一個大約１４.5kb左右的plasmid transformt到DH5a後挑出
: 第一天養個幾cc做確認時沒有發現任何雜plasmid
: 第二天,拿一點第一天菌做subculture後抽plasmid發現會出現雜plasmid
:
: 1.拿第二天的菌做streak,可以分離出我要的plasmid跟雜plasmid
: 分離出的菌再經過第1天的培養確認,沒再出現雜plasmid,但再養第二天時
: 那雜plasmid就又出現了
: 2.雜plasmid切出來的BAND都與前一天結果一樣,但我沒個別分離出來抽plasmid確認,
: 只是與我要的plasmid混在一起看的,能辦認出的酵素除了single cut外
: 只有另外二個酵素
: 許多酵素切出來的長度幾乎是重合的,但是如果經過第三天的培養後
: 可看出一些低bp的BAND會比高bp的BAND還亮
: 所以我想有可能是菌自己剔掉的
: 這部份是否有可能?
: 3.有用plasmid另外transform一次,但結果跟streak一樣
: 4.LB方面應該沒汙染,人為操作方面就不太確定了
: 5.假如我推測沒錯的話,有哪些strain比較不會剔plasmid呢?
: 我的construct有PGK,Neomycin,polyA,SV40polyA,rabbit B-globin polyA
: loxP,我的基因,其他genome序列,
: 6.還有哪些情況會導致我這結果發生?
:
:
: --
: ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
: ◆ From: 140.130.98.94
: 推 tsubasawolfy:有沒有可能是序列跟DH5A chromosome相近造成一些 06/23 20:08
: → tsubasawolfy:repair system或者RE相近也作用在上面? 06/23 20:08
: 推 jsi:plasmid較大時常見這種剪接現象 我是重新設計construct只保留 06/23 22:36
: → jsi:必須要的部份 盡量讓plasmid小於10K 不知是否有人可提供如何養 06/23 22:38
: → jsi:超大plasmid的訣竅呢? 06/23 22:39
: 推 blence:有篇paper要clone一個10kb的gene就用STBL2這個strain,而且 06/23 23:25
: → blence:除了跟invitrogen買，台灣還有一些lab保留 06/23 23:26
: 推 williamyang:我現在用STBL3,效果還不錯. 06/23 23:52
: 推 yaliu:可以問一下嗎？為什麼菌會剔掉plasmid?DH5a不是已經把一些 06/24 02:24
: → yaliu:基因做突變了嗎？recA endA之類的，不是應該可以穩定保存 06/24 02:26
: → yaliu:質體？？？ 06/24 02:26
: 推 rimeni:養在30度而不要養在37度~ 06/24 11:53
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.213.149
※ 編輯: desirable 來自: 140.120.213.149 (08/10 18:28)
推
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我想應該是沒有亂切，我是用 SalI 和 BamHI 把 insert 從原本的 vector 切下來，
再用這兩個切位接到 GFP vector 的 MCS 裡面。
RE check 的時候也是用 SalI 和 BamHI 做 check，同時以 insert 來源的 plasmid
作為 control。Insert 來源的 plasmid 很順利地用 SalI 和 BamHI 切出 10 kb 的
band，而我做的 construct 卻只能切出 9 kb 左右的 insert（當我再做一次的時候
更誇張，各種長長短短的 insert 都有，vector 的尺寸倒是非常標準一致的 4.7 kb）。
我也有將 construct 送定序……定出來的東西是 GFP vector + E. coli 的
genomic DNA……冏rz （GFP vector 上的序列剛好對到 SalI，就是我接進 insert
的切位，從 SalI site 以後的序列就變成 genomic DNA ……我猜這應該是我有
成功的把 insert 接到 vector，只是它重組了！冏rz冏rz冏rz）
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我有把 12hr、24hr、48hr 這三個時間點長出來的 colonies 各挑幾顆，結果都一樣…
請問為什麼放的時間不夠久，挑到的就會是切斷的呢？謝謝。
※ 編輯: desirable 來自: 140.120.213.149 (08/11 11:11)
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真是感謝分享！！
您好像這方面經驗很豐富，請問關於「放的時間不夠久,挑到的是del mutant的機會
就大」這件事有沒有相關的 reference 可以參考呢？因為我對這方面是只知其然而
不知其所以然……
原來養mini的時候也這麼嚴格，我會再試試看的。
請問還有沒有什麼訣竅或是要注意的地方呢？
又如果，我都是養了 mini 之後再拿去養 Mexi，然後才用 Mexi 抽 DNA，要怎麼判斷
那管菌液能不能用呢？是不是也要放在 30℃ 養到 48hr 才可以收呢？
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是呀，但是我第一次 transform，是放在 37℃ 培養 12hr，長了兩顆，挑起來養 mini
（也是 37℃）後抽 DNA，用 RE check 卻是錯的。
第二次 transform，也是放在 37℃ 培養 12hr 挑起來養 mini 也是 37℃）後抽 DNA，
用 RE check 是對的。然後我是用這批產物去做 construct。我當時還沒有「要放在
30℃培養的觀念，所以現在我有點擔心，會不會這批 plasmid DNA 也有重組，只是我用
RE check 時剛好看不出來而已……正在考慮要不要連這個 plasmid 也重新
transform 再養菌抽 DNA……
再次感謝你的分享~我為這個 construct 折騰一年半了，現在總算看到曙光……
我真的很希望能把它做出來，希望下一次可以成功！
※ 編輯: desirable 來自: 140.120.213.149 (08/11 13:49)
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