Re: [方法] 關於ligation
要搞懂還是弄一套 molecular cloning 來看看比較好
※ 引述《Johnpolo (隱行)》之銘言：
: 想請問一下 我現在抽完RNA 然後是不是要轉cDNA才能ligation
: 那是要用什麼方法 是用一般PCR 還是RT-PCR
RT-PCR 平常是指 real time 吧？
你說的狀況 是要先用 reverse transcriptase （配 poly-T primer）反應一次
製造出單股 DNA
然後拿去跑普通的 PCR
: 然後PCR後的雙股DNA不是 線性的嗎? 然後要怎麼Ligation
對 ligate 到 plasmid
: 假如是ligation到質體 是不是要先用限制脢切
看你用哪種 cloning 方法
基本的方法就是在你 PCR 的階段, primer 就設計有切位
PCR 出來拿去切 然後接進也是切過的 plasmid
但是你也可以用 TA cloning:
TA cloning 用的 plasmid 你拿特定的限制脢去切會兩頭都切出一個 t overhang
（也可以直接買切好的）
而 PCR 產物 如果你的 polymerase 用的是不會 proofreading 的（比方說Taq）
PCR 出來兩端其實都會有一個 a overhange
所以這樣的 PCR 產物就可以直接接進去 不用先切 當然 方向要靠運氣而且 TA vector
很多都不是 expression vector, 所以還要再 clone 到你真正想要的 plasmid 裡
但是手上先拿到 target gene 的 TA construct 安心很多 XD
: 可是聽別人說只要heat shock就可以 我現在很不懂
heat shock 是 transform 時的步驟了吧
如果你是說 PCR 產物直接拿去餵給 E coli, heat shock 一下就可以進去
我就沒有聽過類似的技術了
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 131.212.221.169
→
04/03 12:43, , 1F
04/03 12:43, 1F
推
04/03 23:40, , 2F
04/03 23:40, 2F
→
04/04 00:31, , 3F
04/04 00:31, 3F
→
04/09 18:39, , 4F
04/09 18:39, 4F
討論串 (同標題文章)