[求救] Ligation的cutting site接近

看板Biotech作者 (絕心忘情)時間15年前 (2010/11/03 02:19), 編輯推噓0(007)
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我在進行的實驗是將一段A基因約1kb 接入pCambia2301這個vector約13kb 所用的cutting site為BamHⅠ與XbaⅠ 所用的條件如下 Insert 10μl Vector 4μl bufferA 2μl bufferB 2μl Ligase 2μl 4℃反應overnight 做了數次卻接不起來 基本上我的A基因與vector都check過了 所以我在猜想 是否是因為我選用的這兩個cutting site相鄰 導致用酵素切的時候沒辦法兩端都切 不知版上有經驗的版友 有沒有遇過類似的問題 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 218.35.25.28

11/03 02:43, , 1F
網路上似乎也有人用相同的cutting site.
11/03 02:43, 1F

11/03 02:44, , 2F
你可能要check一下 vector和inser的濃度. 放個1:10黏看看
11/03 02:44, 2F

11/03 02:45, , 3F
如果是益生的ligase system bufferB 似乎是加強blunt end
11/03 02:45, 3F

11/03 02:47, , 4F
畢竟size相差有點大..
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11/03 02:48, , 5F
所以inser可以考慮多放點...
11/03 02:48, 5F

11/03 02:50, , 6F
室溫ligation 2hr, 可以多做一組+0.5ul 10mM ATP 看看
11/03 02:50, 6F

11/03 19:37, , 7F
謝謝
11/03 19:37, 7F
文章代碼(AID): #1Cq5P1Xe (Biotech)
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