[求救] 長片段ligation>"<

看板Biotech作者 (Windys)時間15年前 (2010/10/21 13:29), 編輯推噓8(8推 0噓 31→)
留言39則, 11人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
有用/ligation爬過文+ligation精華區搜尋Q_Q 我的insert4.7kb, vector9.2kb insert是PCR後先接到invitrogen的pCR BLUNT vector，總之是個可以接入blunt-end PCR 產物的vector之後再用XbaI切出來，gel elute。 vector則是直接切XbaI後gel elute，不做CIAP。 insert跟vector都處理好後，insert&vector先60度C加熱10分鐘(學姐的紀錄本寫的..) 然後insert跟vector以3:1比例加ligation, 16度C overnight。 之所以不做CIAP是因為只要做了就沒有菌落!!unit是照說明書加的，時間縮短到15分鐘 還是沒有菌落....以往同樣unit條件，30分鐘control就可以降得很低效率也很好.. 已經快把各種奇怪條件都試過一遍了還是接不出來>"<而且實驗室中沒人接過這麼長的 片段... 真的很奇怪，作CIAP連個細菌渣都沒看見，不做又長一堆空包彈，我快瘋了!! 懇請各位版友幫幫我Q_Q我已經接了三個月了Orz...... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 163.15.174.211 ※ 編輯: windyflyer 來自: 163.15.174.211 (10/21 13:29)
推
10/21 13:56, , 1F
這時候就要推TAKARA的ligation mighty mix~
10/21 13:56, 1F
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10/21 13:56, , 2F
用了也是一樣的結果 所以我才想哭ˊˋ
10/21 13:56, 2F
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10/21 13:57, , 3F
vector做CIP會比較好,減少background.
10/21 13:57, 3F
推
10/21 14:43, , 4F
跟我相同的狀況，用的東西也一樣 我是7k+2k QQ
10/21 14:43, 4F
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10/21 14:45, , 5F
我也是用XbaI切，一樣CIP後就是不會長，沒做的就全部自接
10/21 14:45, 5F
剛剛跟學長討論了一下，因為我們實驗室用的CIAP比較特殊(promega)，是先用buffer dilute過的，要用的時候直接加稀釋的reagent就好，而學長他是都從酵素母管取未稀釋 的ciap，我想今天重新處理vector之後會分一半來重新ciap吧! 都試試看囉.... 至少不要連個雜菌都不長給我啊Q_Q" 有菌有希望咩>"< clone恆久遠一顆永留傳啊!! ※ 編輯: windyflyer 來自: 163.15.174.211 (10/21 15:06)
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10/21 17:03, , 6F
請問一下DNA ligase的廠牌?
10/21 17:03, 6F
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10/21 19:15, , 7F
EPICENTRE T4 LIGASE
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推
10/21 19:28, , 8F
vector是XbaI單切嗎 如果是單切的話一定要CIAP
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10/21 19:29, , 9F
不然應該會滿滿都是自接XDD
10/21 19:29, 9F
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10/21 19:36, , 10F
現在的問題點就在...一做ciap那個盤就好像中毒了一樣
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10/21 19:37, , 11F
連雜菌都不長一顆>"<跟沒塗東西一樣.....
10/21 19:37, 11F
我也是CIAP愛用者，我以往成功的且兩邊切位相同的clone都是做CIAP 但現在踢到鐵板，這段clone只要做了CIAP，塗盤的結果就是一顆菌都不長 連雜菌都沒有...整個盤非常乾淨就跟新的一樣= =" 不然人家也想做CIAP呀Q_____Q" ▁ ※ 編輯: windyflyer 來自: 163.15.174.211 (10/21 19:40)
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10/21 23:21, , 12F
Antarctic Phosphatase
10/21 23:21, 12F
推
10/22 14:28, , 13F
前lab在做>15kb時會用電的transformation..
10/22 14:28, 13F
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10/22 15:10, , 14F
我們實驗室只電細胞..沒聽過學長們有用電的= ="
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只聽過電細胞 沒有電細菌=口="
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10/22 15:42, , 16F
要不要試試別人家的CIP 你以前經驗的CIP 也是promega的?
10/22 15:42, 16F
推
10/23 16:58, , 17F
我想CIAP還是要做 換Antarctic phosphatase比較好用
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10/23 16:59, , 18F
ligation insert給他加到破表(10:1) 溫度4度20小時以上
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10/23 17:00, , 19F
vector的話大概總量150ng就夠了...
10/23 17:00, 19F
推
10/24 00:44, , 20F
你的質體總大小有點大耶～會不會其實轉不進去？
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電店的看看效率會不會提昇
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有沒有可能在liagtion那一步先確認有沒有黏好，PCR看看？
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用vector的primer PCR看看有沒有黏起來，不過ligation產物通
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常不好P....建議濃度可以提昇。加油～
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CIP其實我也建議你做，不然一堆空的也是挑心酸的
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10/24 00:49, , 26F
不想做CIP的話，就只好換個不一樣的切點囉
10/24 00:49, 26F
可是之前學姐有接出來過....確認也都沒問題 我現在是把這段做改造所以要重接 方法是用學姐記錄本寫的方法去做。回ArthurYao, 一樣都是promega的!! 這次有做ciap了,改從新管裡取酵素 不過這次用新的盤抗生素好像太多了(小聲) 只長了一顆 明天看情況再重新處理vector(小小聲) 4度C我也會試試看, 因為學姊的紀錄本裡是有用過但是結果沒有很好, 所以才沒採用.. 至於換切點,因為這段一開始是用PCR夾出, 不然根本沒有適合的切位, 如果換切點等於 要重訂primer, 老師會把我宰掉的^^" 至於用電的 實驗室沒有那樣的儀器 學長也叫我先不用考慮 囧" 再次謝謝版友們指教!!目前正在一一試condition中 希望能早日接出來>"< ※ 編輯: windyflyer 來自: 163.15.174.205 (10/24 16:05)
推
10/25 12:38, , 27F
gel elute後濃度高嗎 有時候濃度太低會接不進去
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10/25 18:06, , 28F
回樓上 濃度夠高唷 band很清楚
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10/26 10:34, , 29F
用cip處理過完全不長 多少會懷疑cip是不是有污染了 XD
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10/26 10:34, , 30F
另外抗生素太多 多放久一點點就可以平衡回來了 XD
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就我們以前的經驗 大片段對接在ligation的時候會使用
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10/26 10:37, , 32F
低溫4度o/n 然後要transform的時候也會incubation久一點
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10/26 10:38, , 33F
因為大片段比較不好進cell 可以試試看 我是懷疑CIP啦 XD
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10/27 17:34, , 34F
cip換掉了~我想看看今天的結果!!
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10/27 17:35, , 35F
至於4度C O/N 我會再試一次看看>"<因為上次4度C結果
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10/27 17:35, , 36F
control長得比實驗組多...
10/27 17:35, 36F
推
10/29 23:35, , 37F
↑negative control嗎? nc長太多要check cip反應喔=.=b
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10/29 23:35, , 38F
重點是實驗組有長嗎....?
10/29 23:35, 38F
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10/31 23:54, , 39F
先回樓上都有長 只是nc長比較多
10/31 23:54, 39F
最新戰況!! 今天新塗的盤出來了，negative control沒長... 但是實驗組長出來了呀啊啊啊啊啊~~~~~~晚上已經把菌都挑一挑明天要來抽mini check! 我這次換新的ciap酵素，vector有ciap過，分別在16度跟4度ligate兩天transform， (然後我就回家拿生活費zzzZZZ) 今天看了收的盤.....control 0顆, 實驗組都有大約20顆~!! 我又額外多做了一組ROCHE的ligation kit本身有自己的ciap酵素,長很多!!大概幾十顆 我預估有到100顆~~ 菌養下去了明天看結果!!我很期待>"<如果順利接進去我再把所有的流程仔細po上來!! 非常謝謝這些天來大家的建議,還有人特地站內信or水球>"< ※ 編輯: windyflyer 來自: 111.254.208.93 (11/01 00:03)
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