[求救] plasmid construct雙切鑑定對,但是定序 …
我把一段序列X從A plasmid amplify出來,然後接到B plasmid上
A plasmid是我之前已經做好,插入了X與GFP gene的fusion sequence,使用BamHI和EcoRI這
兩個cutting sites
B plasmid則是vector本身帶有GFP gene且IRES也和A plasmid不一樣(其他部分皆相同).使
用BspEI和EcoRI這兩個cuttinf sites
(BspEI和EcoRI是前後相鄰的兩個cutting site)
接進去的X序列大小約1 kb
compentent cell是DH5α,用Amp篩
抽plasmid用BspEI和EcoRI雙切鑑定,有切出1 kb的band
到這裡一切都很順利,結果定序卻................................................
我送5個樣本去定序,有兩個比對結果顯示沒接進去,有三個是根本測不出來,反應失敗(囧)
之後,我分別拿amplify X序列的primer和sequencing primer做PCR
sequencing primer那組有一條1 kb的band
amplify primer那組什麼都沒有 (再囧)
我有想過:
1.換掉BspEI
2.汙染?! 換過水,LB broth/plate,Amp等等
3.實驗室助理是建議我,乾脆就直接抽plasmid做cell transfect,然後上flow看有沒有表達
除此之外,請問還有哪些地方是我可以再做調整的,懇請各位前輩指教,謝謝!
(這個plasmid construct做了快一個月,沒做好我就不能做接續的實驗,現在被卡在這裡都
快瘋了 >""""""""""<)
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 118.171.83.221
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補充一下,序列X是某menbrane protein的ORF
我之前有用過A plasmid做過transfect和infect,在transfect這一步可以看到
fusion protein確實表達在細胞膜(by confocal),但是infected cell卻是在胞內表達GPF,
所以才想說,是不是因為在C'加了一大串東西導致它不到膜上,然後換個本身帶有GFP的
vector @@"
※ 編輯: peowen 來自: 118.171.83.221 (08/04 13:18)
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