[閒聊] 轉cDNA定量的方式請教

看板Biotech作者 (歐~天呀)時間14年前 (2010/07/13 21:31), 編輯推噓6(6推 0噓 10→)
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今天我老闆突然對要口試的學姊問說 你們抽完total RNA,轉成cDNA後怎麼進行定量 我學姊說,我們使用同一管的cDNA,取等量體積 一個去做PCR 測目標gene的量， 　另外再用　Actin的primer去夾同體積的ｃＤＮＡ來定量 　結果............ 　我老闆和另外一位老師，提出說 不是應該同一管cDNA，裡頭分別加入目標gene的primer和control的primer才對嗎？ .............. 以上是奇怪的論點，想請教版上的前輩，真的有人這樣做嗎？ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 114.47.212.206
推
07/13 22:06, , 1F
要先看目標gene的和control的primer會不會互相干擾才可
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所以說只要不會cross link，理論上方法可行？但實際上真的
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07/13 22:24, , 3F
有前輩是這樣進行實驗的嗎？或是早就用real-time啦 XD
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07/14 00:09, , 4F
是有這樣用沒錯, multiplex PCR
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推
07/14 00:38, , 5F
理論上是這樣，但primer之間會干擾！taq效率也會變差
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推
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請問一下，target primer跟internal control primer的效率
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不同要怎麼做才能準確定量
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理論上，還是要用Multiplex，因為這可以保證你的pcr mix是用
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相同的東西
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有的primer的確會互相干擾 所以 保險起見是分開做
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我有遇過加在一起 目標基因P不出來 control可以
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但是目標基因跟control的primer分開p之後 就很正常
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推
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除了primer外，其他先mix後分裝，再加入primer PCR
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這樣應該可以算一樣吧？分裝就算取樣誤差應該也不會差到哪？
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推
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推樓上的作法
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推
07/14 17:23, , 16F
可以試試看 不過通常會跑multiplex PCR的primer有特別設計吧
07/14 17:23, 16F
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