[求救] 請教關於BL21(DE3)pLysS破細胞的方法

看板Biotech作者 (小蘋兒)時間14年前 (2010/05/17 20:59), 編輯推噓7(7推 0噓 11→)
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小妹近日在作蛋白質表現 是將我的insert接到pET20b(+)然後再轉型到BL21(DE3)pLysS作蛋白質表現 我的作法是 先加入1/100 over night的菌液培養在37度refresh到OD=0.4--0.6 然後加入0.1mM的IPTG於25度培養六小時,100rpm 離心去掉上清液加入sample loading dye 在沸水中煮10分鐘 然後去跑10% SDS-PAGE 可以看到很明顯的induction結果 作Western也確定那就是我要的protein 可是之後作大量約300ml培養條件一樣 然後一樣離心去掉上清液後加入15mlextraction buffer混合均勻 去打sonication 打10s'停10s'總共打1hr 在上清的部分有看到我要得蛋白質(可以濃度很低) 可是在pellet的部分也有看到我要的蛋白質>< 這是破菌破的不完全嗎?要怎麼樣才可以破菌破的比較完全呢? 我之後會通Ni-NTA column來純化我要的蛋白質 還是我可以直接加入native binding buffer去打sonication呢? 這樣效果會比較好嗎? 感謝各位 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.109.49.158
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inclusion body
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05/17 21:29, , 2F
你的protein該不會是要純化做antibody吧(菸)
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05/17 21:52, , 3F
有inclusion body就會玩到爆炸了..antibody有考慮細胞生產嗎?
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05/17 22:58, , 4F
是要純化做antibody的!!!可是上清也很清楚有我要的蛋白質
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推
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French press會比較好,誘導前,先在25度c30分鐘,再加IPTG
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推
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sonication效果有限 尤其是放大規模後
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eppendorf打的破 同樣條件在離心管不一定破的完全
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french press效果會好很多
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在小量的時候,就應該先拿去sonicate,確定蛋白可不可溶
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05/17 23:37, , 10F
小量induction確定蛋白可溶,再考慮是不是破菌方法不夠好
05/17 23:37, 10F
推
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小量確定不溶的話,調整IPTG濃度,溫度,induction時O.D600
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再不行就換vector和Host
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推
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補充一點 如果是破菌的問題,又沒有辦法借到French press
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可以先Freeze&Thaw幾次,或是加Lysozyme
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05/17 23:47, , 15F
這樣前處理完,就已經可以看到稠稠的DNA跑出來了
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推
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可以試試用urea 然後在慢慢置換回原本的buffer
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推
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推三樓 有inclusion body就會玩到爆炸了!!!
05/18 18:56, 17F
推
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IB本身就不是正確的folding 上清有你要的也白搭
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