Re: [閒聊] 板上做　protein純化的版友（ＦＰＬＣ）

看板Biotech作者Fourfish (～四條魚～)時間14年前 (2010/05/10 12:40)推噓8(8推 0噓 4→)

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※ 引述《hellheavn (蒼天落日)》之銘言： : 不知道版上的版友有沒有人在專門摸FPLC : 或是有用過的 : 通常你們會遇到什麼樣的問題都如何解決咧 : 或著是清洗保養有什麼見解咧 : 想說來個推文或是討論串交流一下 : 小弟不才摸了一年還是一知半解的.... 分享一下使用經驗~ 因為我老闆曾跟我說：如果這台或這隻column壞了的話你明天也就不用出現了...(抖) 首先建議使用比較高階的儀器能請專員示範教學一次是最好的再不然至少要請使用過的在旁帶領使用因為使用不當不只是儀器損壞有可能會造成人身傷害再來預先作好防範比之後造成問題來的好如果有問題就通知原廠請專員來處理吧注意事項要看你用什麼column 一隻10萬塊的gel-filtration column的話那就請小心謹慎並愛護的使用如果是自己買resin來packing的小column 變慢、塞管或清潔還可以自己重packing就好在使用時不要爆管造成人身傷害就好= =a 我以gel-filtration column為例好了一些要點需要注意的：第一點、最重要的一點 "壓力" FPLC是透過幫浦加壓以推動溶液在管柱中流動系統和column各有自己能承受的壓力限度 (說明書有寫) 所以使用時務必要注意壓力值的大小壓力太小溶液推不動壓力過高會造成系統受損或管柱爆管而FPLC大多都使用玻璃管柱所以可想而知爆管的話...還蠻可怕的...(抖) 之前聽專員說有實驗室爆過 "碰"的一聲就粉碎了還好那隻column是有外套的(外面還有一層可恆溫的) 所以碎片沒飛出來... 現在系統應該都有安全設定請以壓力限度最小的為設定值以策安全接下來其他點大多都由壓力這點延伸出來的第二點、流速流速越快壓力也越大除了爆管問題外流速太快長期會造成resin bed被壓縮影響分離效果但流速太慢實驗也就跑越慢老闆催data壓力也就越大... 所以自己平衡一下兩者壓力...|| 自己實驗室應該都會有規定使用的流速所以請照規定使用而普遍(我所能看到的...)使用的流速大概在1ml/min左右或以下第三、雜質顆粒性雜質是不被允許的包括藥品不溶物、灰塵、毛屑等造成塞管無法清除而降低流速、分離效果壓力上升等因此所有要進FPLC的溶液包括buffer和protein 一定要過0.22 um filter 除掉雜質如果有雜質進入自己packing的column還可以拆掉清理一下再重新packing 但如果是整隻買來的...專員曾跟我說：我可以幫你重packing啦但效果一定會變差... 因為原裝column在packing時有壓力設備填裝resin時可保持整隻column密度均勻但自己packing因重力關係下層一定會比較密實所以不均勻效果會有很大的差別送回原廠重packing？似乎沒那個服務不然就是要白花花的銀子啦...@@a 第四、氣泡 column原則上不可以有氣泡在裡面氣泡會使壓力提高以及影響column的均勻度若長期氣泡有存在會使部份resin乾掉就壞啦~ 所以進入FPLC的溶液要degas 免得在column中聚集出氣泡 degas有不同方法通說還有degas專用的儀器@@a 有人也用sonication的方法而我是用抽氣的反正都要過濾了所以就在抽氣過濾後讓它多抽久一點就好第五、蛋白質樣品打進column的樣品越乾淨當然column也就不會有太多髒東西卡在上面基本的離心、過濾是一定要做的以gel filtration為例的話最好把gel filtration當作second column 之前可用ion-exchange或affinity column做第一次純化分離大多細胞碎片、lipid、雜protein 再進一步純化可保持second column乾淨之後清潔也比較容易還有一點比較特殊也比較容易被忽略那就是蛋白質令人又愛又恨的特性 "沈澱" 特別是蛋白質有經過濃縮的那請注意一下蛋白濃度跟buffer的成份因為蛋白濃度太高會沈澱、buffer改變也可能使蛋白沈澱如果跑FPLC用的buffer跟蛋白質所濃縮的buffer不同時要稍微注意一下是不是這樣的轉換會讓蛋白質沈澱出來免得樣品一打進FPLC 全部沈澱卡在column裡可就欲哭無淚了...賠了蛋白又折column... 第六、溶液注意一下說明書可用的藥品及濃度限制盡量避免強酸強鹼強氧化強還原及高urea等條件可降低column的損壞另外高鹽也要稍微注意一下用完最好馬上清洗不然小心鹽類結晶析出卡住管路喔~ 第七、清潔及保存專員告訴我如果短期(3-5天)不使用可以用MQ水清洗保存即可如果是長期不使用(7天以上) 最好將column用20%酒精清洗並保存可避免微生物長出來... 當然不同的column有各自的清洗及保存條件所以請參照說明書喔！保存方面記得將開口鎖好封好免得水分揮發而有空氣進入第八、其他其他如使用時的設定等就看自己的實驗性質了但使用前也有一般該注意的五大點： UV光是否有開(或其他detector)？Fraction是否準備好？Buffer夠嗎？Protein打了嗎？ Program設定對嗎？第九、問題解決分享兩個 1.一隻column使用久了因為液體流動跟重力的關係下面的resin一定會越來越密這時怎麼辦？我老闆說可以把column整隻倒過來跑...均衡一下... 這是他之前實驗室的方法...這我沒試過... 2.如果發現管路有空氣跑進column中的話怎麼辦？說明書應該有寫。我們家的那隻它寫說...整隻倒過來跑把空氣推出... 試過有用但不見得全部推的出來就是了... 所以如果看到有空氣能的話趕快把機器停下把空氣排掉再繼續吧我家也只是一台小低階的FPLC 目前能想到的大概就這些了~ 希望對大家能有幫助祝實驗順利~!! -- 我不是業務專員 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.94.157 ※ 編輯: Fourfish 來自: 140.116.94.157 (05/10 12:42)

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ROKEE

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