[求救] western做不出來

看板Biotech作者 (whale)時間14年前 (2010/03/31 00:30), 編輯推噓3(3推 0噓 9→)
留言12則, 7人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
我是跑10%SDS PAGE，樣品是豬精子 使用半乾式轉漬，條件是5mA/cm^2，40min blocking 1hr 一抗則是染overnight 二抗1小時，用AP系統呈色 我的問題是，用來做control的tubulin一直出不來 一抗是使用sigma的mouse anti tubulin，稀釋500倍(新買的，保存在-20，解凍不超過3次) 二抗則已經試過我們家那個放不知道幾年的還有跟另一間實驗室借來的二抗(確定可work) 二抗放到一千倍(正常是稀釋5000倍)了，出來的只有背景跟淡到不行的band 由於這個情況以前沒發生過，現在正在一個點一個點的確認 向大家請教問題有可能在哪呢?再做不出來就不用投摘要了ˊˋ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 59.126.202.132
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03/31 00:55, , 1F
我們家是每片50mA 1hr。 這是transfer沒轉好嗎?
03/31 00:55, 1F
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03/31 01:08, , 2F
已經用ponceau S確認過，另外這情況之前沒發生過
03/31 01:08, 2F
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03/31 01:15, , 3F
背景 是說雜訊? ECL DECAY?
03/31 01:15, 3F
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03/31 01:25, , 4F
背景應該是因為二抗放太濃(1000X)
03/31 01:25, 4F
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03/31 01:31, , 5F
對了，兩個月前一切正常
03/31 01:31, 5F
推
03/31 10:50, , 6F
請確定此支Ab之epitope可辨認你的樣品
03/31 10:50, 6F
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03/31 10:51, , 7F
另外關於你的樣品中endogenous tubulin量的多寡
03/31 10:51, 7F
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03/31 10:52, , 8F
可以跟別人借一個確定有明顯tubulin表現的sample
03/31 10:52, 8F
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03/31 10:52, , 9F
當作loading positive control
03/31 10:52, 9F
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03/31 22:41, , 10F
先確定一抗是不是認得"豬"的tubulin
03/31 22:41, 10F
推
04/02 01:16, , 11F
多loading一個 你確定你的一抗可以看的很清楚的sample...
04/02 01:16, 11F
推
04/10 22:31, , 12F
blocking 1小時好像有點短的感覺
04/10 22:31, 12F
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文章代碼(AID): #1BiYSiUc (Biotech)
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