Re: [求救] 請問如何將兩段基因同時插入同一個vect …
※ 引述《yaliu (雅)》之銘言：
: ※ 引述《ricebaby (小蘋兒)》之銘言
: : 請問各位
: : 小妹我目前準備要構築一個質體
: : 含有分別為700bp與1.4K片段的insert(抗體的light chain&heavy chain)
: : 要送入pET20b作蛋白質表現
: : 但首先我必須先利用PCR將這兩段原本接在pEGFP-N1的insert P出來
: : 請問各位我該如何設計primer呢
: : 目前我想到的是
: : 1.restriction enzyme site-(NdeI)--insert1---restriction enzyme site(EcoRV)
: : 2.restriction enzyme site-(EcoEV)--insert2---restriction enzyme site(XhoI)
: : 因為我對了pET20b 的sequence map ,restriction Enzyme site有inframe的只有
: : EcoRV&NotI&XhoI
: : 所以選擇了EcoRV不知道這樣設計對不對 ??
: : 然後就利用PCR將兩個片段分別P出來 之後我想到的作法有兩種 想請問大家的意見
: : 1.將PCR P出來的兩個片段分別送到pET20b-->挑clone-->送定序
: : -->再利用EcoRV 將兩個plasmid各切一刀-->ligation-->transformation-->挑clone
: ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
: 不可行
: 質體最後會self-ligation--->這個不是你要的
: vector-insert1-EcoRV-insert2-vector --->這個應該是你的理想形式吧，
: 但會有兩個ori，不可能轉形成功
: 不過可以賭賭看成功率，就是你的ligation產物，假使剛好insert1-EcoRV-insert2有成
: 你可以直接ligation產物作PCR(insert1 forword primer & insert2 reverse primer)
: 但我覺得失敗率挺高的.....（好像跟你第二個方法有像到）
: : -->定序
: : 2.將PCR P出來的兩個片段先利用EcoEV切一刀-->ligation
: : -->用原本insert1的forward primer-NdeI&insert2的reverse primer-XhoI進行PCR
: : 將合成的片段放大-->Enzyme digestion(NdeI&XhoI)-->ligation送入pET20b-->
: : transformation-->挑clone-->sequencing
: 這個比我剛剛的提議成功率高
: 不過記得設計的切點旁邊要空幾個mer
: : 請問各位以上兩個方法可以行的通嗎?可以幫我分析一下優缺點嗎?
: : 還有其他該注意的事項嗎?
: : 感謝各位
我覺得第二個方法把兩段insert直接接起來後 純化 就可以直接接到vector上了
一開始用PCR放大出來的量都很大
因此你只要純化出 1ug 的insert1+2 ligated product
就夠你接到vector上好幾次了(況且你只有一個地方可以黏 沒有反接問題)
現在很多酵素都可以切很久 就切久一點確保反應完全嘛
之後 避免vector的自接 就用CIP吧
先把vector 5'端的phosphate拿掉 純化出來
再和insert做ligation 產率會很高的
但記得反應完CIP的活性一定要去掉
否則會在接下來的ligation中連insert的磷酸都不見
T4 ligase一定要有一端有磷酸才能接的
不過即使你不想花錢買這個 挑個10個colony去定序 也一定會有你要的吧...
P.S.PCR完你可以同時用限制酶和DpnI切 確保你最後定序不會看到template...
P.S.2.你用的Pfu算是常用來做長bp的 不太需要擔心PCR完序列會錯
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