[求救] 為何SDS-PAGE跑出W形狀的Band?

看板Biotech作者 (jck)時間16年前 (2010/03/17 19:34), 編輯推噓17(17推 0噓 40→)
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我將某片段clone完，用E. coli(BL-21)表現 vector為 pPAL7 我的目標產物為11 kDa (clone之片段2.75 + Fusion protein 8.25) 可是SDS-PAGE卻跑出W形狀的Band 奇怪的是，其他的Band都很正常 Fig. 1: 15% SDS-PAGE http://www.wretch.cc/album/show.php?i=jck0406&b=2&f=1974080582&p=0 Marker最下面那條綠色的band為10 kDa (不是很清楚，有點偏藍，不過就是W狀Band旁邊那條) Lane 1, 3, 5為破菌後上清液 Lane 2, 4, 6為破菌後沉澱 跑了蠻多片SDS-PAGE，奇怪的是有時候退染太久，W狀的BAND會不見 後來我怕退太久，只退染一次後，就夾在投影片中(scan用) 結果隔天W狀的Band就變透明了...! Fig. 2: 18% SDS-PAGE 變透明了! http://www.wretch.cc/album/show.php?i=jck0406&b=2&f=1974080583&p=1 Fig 3: 18% SDS-PAGE 退到有點淡，不敢再退了(不小心用破了...) http://www.wretch.cc/album/show.php?i=jck0406&b=2&f=1974080584&p=2 其實我不太知道那條W狀的Band是如何產生的 不知道有沒有人遇過這種情形 最後我還是搞不懂那條W狀的Band到底是不是我要的產物 因為Fig 2, 3這兩張的Lane1, 2是control(沒加IPTG) 可是在上清液(Lane 1)還是有那條11 kDa左右的W狀Band 請各位高手指點迷津~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.127.27.213
推
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應該是protein量太高而擠壓變形,不然其實這還可以接受啊
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推
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我感覺是沒跑好，連上面你說正常的 我都覺得不太漂亮
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而且整條lane 有點歪歪的
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推
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那不是protein 你的sample sup部分有汙染到其他東西
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to 3F，因為我目前實驗室的做法，就是會在破菌後
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直接用loading dye回溶，所以loading dye都會加很多。
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不像其他實驗室會依照比例2X or 6X稀釋。
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03/17 22:47, , 8F
所以有可能是loading dye加太多嗎?
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不過這樣的話我sample沉澱的部分應該也會有W型的band阿XD!
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推
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蠻正常的啊 我做表現跑電泳 如果dye沒跳海還蠻常看到的
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我都認為那只是dye的問題而已 XD
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推
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基本上我覺得你的sample製備可能有問題，所以band歪歪的甚
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至有點smear。另外，你有無加IPTG皆會有那條band，所以那應
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該不是你的產物吧....還有想問一下，破菌後沉澱是什麼意思阿
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正常來說不都是看破菌後上清液的嗎?
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你可以多跑一個control, BL21[pPAL] 加IPTG induction
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破菌後用dye回溶?上清液是液體，怎麼回溶?難道回溶沉澱物?
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如果這樣還是有W的band 那它就一定不是你要的東西
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不是很了解你的意思耶
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to yaliu，破菌後會離心，因為怕有inclusion bod
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所以也會收集沉澱物，沉澱會直接用dye回溶
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謝謝licat給的意見。
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推
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inclusion body 據說不是還要加尿素之類的嗎?我沒跑過啦
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inclusion bodies
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對阿，要純化要加尿素或其他的藥品讓蛋白質重新摺疊
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推
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你的破菌單純分soluble跟unsoluble吧
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不過IB也是在unsoluble 煮一煮一樣出來
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另外要看你有沒有induction出來做個time course
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會比較容易找
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對，是分soluble & insoluble。可是不太懂你第二句?
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推
03/17 23:40, , 31F
你的pellet用sample buffer回溶後也會煮吧?
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是指純化用加熱的方式讓他重新摺疊@@?
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這邊還不用探討到refolding...要先確定到底有沒有
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對，也會煮，不過我是過有煮和沒煮，結果一模一樣...>"<
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refolding要調的那些不同鹽類跟pH buffer是惡夢
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推
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不然就放大絕用Urea破菌後過column看到底有沒有(如果
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老闆不介意的話XD)
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推
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W應該不是蛋白質 size也太小
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這膠可能做的不好 所以marker也有點歪 不是sample的問題
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推
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單純loading太多 而且看起來你沒讓他跑跳海
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還有看你沒切掉的部分 你stacking的距離有夠嗎?
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不過W應該不是protein沒錯 可能問題在buffer中
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推
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同一個sample做western確認到底是不是那條band
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另外inclusion body有自己的lysis方法,不要直接用dye回溶
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推
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另外w只出現在你的上清液,可見你上清液製備有問題
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推
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應該是protein沒有定量吧你看每條lane的量好像不一樣耶
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03/18 17:49, , 47F
可以試試看Tricine-SDS-PAGE
03/18 17:49, 47F
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03/18 20:57, , 48F
謝謝NKTcell給的意見～ ^^
03/18 20:57, 48F
推
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W看起來不像是protein，而且都是出現在上清液的部份
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會不會是上清液中含有鹽類等干擾物質而影響跑膠結果
03/19 01:19, 50F
推
03/19 01:27, , 51F
檢查一下破菌的buffer~
03/19 01:27, 51F
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03/19 19:38, , 52F
你的樣品應該不太乾淨~
03/19 19:38, 52F
推
03/20 10:24, , 53F
因為會反白，所以應該不是 protein
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03/20 10:25, , 54F
因為band 有扭曲，可以知道某些樣品的鹽濃度相對過高
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因為只有上清有，所以覺得是菌液中的 salt or "小東西"
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03/20 10:28, , 56F
建議是在染色前，可以先用 Q 水泡一下， 30min to 1hr
03/20 10:28, 56F
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03/20 15:29, , 57F
謝謝各位~^^
03/20 15:29, 57F
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