[求救] 請問各位'

看板Biotech作者 (病態)時間16年前 (2010/01/22 18:07), 編輯推噓2(2推 0噓 7→)
留言9則, 3人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
假設今天P了兩段PCR產物 兩段PCR產物5'跟3'各有100多個mer重複 A產物 5'--------------------------3' 3'--------------------------5' 5'-----------------------------3' 3'-----------------------------5' B產物 如何把它們結合成一個完整的序列了(因為這個基因全長我抓不到條件 所以p成兩段) 一樣用pcr的方法嗎 先加熱再結合 再延長? 我有點不懂為什麼博士要klenow fragment來做 直接用taq 不行嗎 請各位幫我解決 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 60.249.152.174
推
01/22 21:33, , 1F
這個應該直接用一般pcr方法做吧，省去94'C 3min這個第一步
01/22 21:33, 1F
推
01/22 21:44, , 2F
A產物forward + B產物reverse primers 用PCR就好了
01/22 21:44, 2F
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01/22 21:45, , 3F
用pfu是為了降低一般Taq的錯誤率
01/22 21:45, 3F
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01/22 23:38, , 4F
樓上他用的是klenow fragment跟pfu有啥關係= =?
01/22 23:38, 4F
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01/22 23:38, , 5F
klenow fragment的特性是5'-3' polymerase activity
01/22 23:38, 5F
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01/22 23:39, , 6F
3' → 5’ exonuclease 這樣原PO大概知道為啥要用
01/22 23:39, 6F
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01/22 23:39, , 7F
klenow fragment了吧@@?
01/22 23:39, 7F
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01/22 23:45, , 8F
只是我如果沒記錯的話好像要控制好klenow fragment
01/22 23:45, 8F
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01/22 23:45, , 9F
維持兩種活性的平衡= =不然做出來又被吃掉
01/22 23:45, 9F
但是整個實驗 我應該沒有要用到3' → 5’ exonuclease阿 因為我是要這個基因的全長 3' → 5’ exonuclease 是要減少複製的錯誤率吧 這樣應該可以選用 有proofreading的 taq就好 不是嗎? 否則選要 kleonow 還要控制溫度.... 不是多此一舉嗎? 還是各位有別的看法 因為我對klenow這個酵素的用處真的不太熟悉 假如要延長的話 是先讓兩股分開 然後彼此的重複的地方會粘上 那這樣tm值要怎麼控制呢 因為我沒做過類似這樣的實驗 希望大家幫忙解惑一下 ※ 編輯: uokoperfect 來自: 124.9.207.51 (01/23 00:51)
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