[求救] zymography做不出來
zymograph做不出來...我是用h1299 cell+20%FBS當positive control
我po一下我的步驟
請高人指點~
1.用RIPA抽protein，和2X sample buffer 一比一混合
2.load 20ug的protein跑膠，stacking用5%不含gelatin，
running用10%含1% gelatin，gelatin預溶在水裡。
3.80V跑20分，然後125V跑60分。
4.wash buffer搖50rpm，30分鐘兩次。
5.用reaction buffer搖30分鐘。
6.換掉reaction buffer，37度overnight，coomassive blue染1小時後退染。
目前還沒看到有白band出來過orz
配方:
sample buffer:0.5M Tris-HCL 2.5ml，glycerol 2ml，10% SDS 4ml，
0.1% bromophenol blue 1ml，dd water加到10ml
running buffer:Tris base 2.9g，glycin 14.4g，SDS 1g，dd water 1L，ph 8.3
wash buffer:2.5% triton-x 100 in dd water
reaction buffer: Tris-HCL 50mM，Nacl 0.2M，CaCl2 5mM，dd water 1L，ph 8.0
另外老師問為什麼gelatin不會跑掉的原理? 另外我染完總覺得上層膠顏色比較淡
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