[求救] 冷凍切片破洞和H&E stain的ㄧ些問題

看板Biotech作者killua1214 (奇犽)時間16年前 (2009/07/22 23:32)推噓0(0推 0噓 32→)

留言32則, 5人參與討論串1/3 (看更多)

其實還蠻多問題的，做了兩個多月，這有ㄧ些問題ㄧ直不時的出現... 在問問題前我先把我大致的實驗流程解釋ㄧ下首先我要看的是小鼠的腫瘤和非腫瘤在小鼠的肝臟中表現的差異我們的小鼠是帶有EGFP這個transgene的小鼠會表現在liver當中流程如下 sacrifice 小鼠取出liver ↓ 4% PFA fix ↓ PBS wash ↓ sucrose脫水(6%,2hr→12%,2hr→18%,2hr→24%,2hr→30%,overnight) ↓ OCT包埋 ↓ -20度冷凍切片(6um) by 切片機 ↓ (儲藏在-30度) ↓ 用90% glycerol+10% PBS, mount cover slide,用螢光顯微鏡看tissue螢光表現 ↓ 用PBS洗掉cover slide，再H&E stain ↓ Hematoxylin ↓ 1% HCl in 70% ETOH (acid alcohol), dip several times ↓ ammonia, dip several times ↓ Eosin ↓ 脫水(70% ETOH→90% ETOH→100% ETOH→Xylene→封片) 結果發生了幾個問題問題1:我的H&E stain後，tissue經常會有破洞，破成網狀..(如果有需要我可以附圖) 問題2:H&E stain後會有非細胞核的區域出現Hematoxylin染上的小點點，有時候還蠻多的問題3:H&E stain的顏色我ㄧ直抓不到一個固定的condition來固定顏色表現，常常會太紅或太紫，有時後染顏色的就不錯很能區分核和質另外，有的時候Hematoxylin染色會有帶狀的情形發生，顏色分不不均勻，我染色都適用染缸，所以理論上上色應該要均勻，除非tissue厚薄不ㄧ(有可能嗎)? 問題4:在染色前我會用90% glycerol+10% PBS, mount cover slide然後看螢光表現，有時後細胞的morphology會變得怪怪的，細胞邊緣不是那麼明顯問題5:另外我想問ㄧ下，ㄧ般OCT放冰箱可以放多久?切好的tissue已mount在slide 上的玻片可以放多久?放幾度? 另外要如何避免開關冰箱對凍切的tissue產生冷凍、解凍的傷害? 不知道有沒有人有類似的問題，最近真的碰到瓶頸，無助>"< 有人可以幫我解答嗎>"< 先謝謝各位了m(_"_)m -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 118.168.135.149

→

vandia

07/22 23:36, , 1^F

07/22 23:36, 1^F

→

schmitt

07/23 01:31, , 2^F

07/23 01:31, 2^F

→

schmitt

07/23 01:32, , 3^F

07/23 01:32, 3^F