[求救] 3'RACE
我有一個case A是gene translocation (EWSR1+未知)
想用3'RACE去定序找出來
case B已知是EWSR1+FLI1 拿來做control
case C則是kit裡面附的RNA
我用的是invitrogen的3'race
第一步從RNA->cDNA
我用b-actin去做PCR
A和B都有得到band (證明我的cDNA還不錯?)
C用GSP和AUAP做PCR 都有得到很好的band (表示我的RACE應該有成功?)
再來我用EWSR1+AUAP當primer
可是A和B都沒有出來
nested PCR有沒有得到好的band
有淡淡的smear感覺
我現在就很迷惑
如果說是未知的基因很長
導致PCR結果出不來
這就很難解釋為什麼case B EWSR1+FLI1會出不來
預期大概是700左右bp
我的elongation用2分鐘了
Tm 60
不知道要怎麼做troubleshooting >"<
我目前是嘗試想換另一種PCR enzyme (HotStar)
不知道幫助大不大
有沒有人有經驗可以幫忙
另外
我有一個很新手的問題
PCR之後都會去做clone
為什麼不能直接送定序呢
是因為會在膠上得到多於一個band嗎
還是有其他原因
如果只有一個sharp band可以直接送定序嗎
謝謝!
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