Re: [求救] 請問有人用lentivirus transduct prima …

看板Biotech作者hshinyi (阿蛋)時間15年前 (2009/04/08 23:28)推噓6(6推 0噓 10→)

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※ 引述《lenti (啄木鳥)》之銘言： : ※ 引述《ssLB (can)》之銘言： : : 如題 : : 我們利用lentivirus package plasmid : : 希望將我們要的mirco RNA送入primary T cell中 : : transduction實驗步驟都依照中研院的RNAi core : : 但是要不就是沒辦法成功要不就是螢光表現量很低 : : 但是我們老闆又要我們上flow看百分比 : : 這樣的話所剩無幾 : : 想請問有人有用過virus成功感染T細胞嗎？ : : 不一定要是lentivirus : : （我們的T細胞已經有先用PHA刺激三到四天了） : : 還是說有哪位知道那個學校有哪間實驗室在做這方面的 : : 麻煩回B信給我！！ : : 感激不盡！！！ : 照你的描述, 問題應該還是在生產virus的步驟. : lenti是由HIV來的, 不可能無法感染 T cell. : 所以我懷疑你的問題出在無法產出足夠titer的lenti-virus. : 先問你幾個問題, : 1. 當你把三個plasmid送到293T時, 293T細胞的transfection efficiency 有多少？ : 理想狀況是要九成以上. : 2. 你的plasmid是否都正確？ : 請先用RE 去確認你的所有plasmid都是正確的. : 3. 你用的293T是從那來的？用那牌的FBS.？ : 有些廠牌的FBS是會讓LV的titer很差的. 而且293T的狀況也會決定你產出的titer. : 你可以列出你所有的條件, 我可以幫你確認一下, 順便給你一些建議. 借用原po的標題（不過我也是想問LV system的問題）我們實驗室包病毒也是titer超低。所以也想知道要怎麼改善方式才會提高titer.. 簡單講一下實驗流程： 1. 若是用GFP觀察transfection efficiency, 用TransLTI transfection reagent, 丟進三個plasmid (pCMV, pMD.G, pGFP)進293T, 　 overnight後換含1% BSA的culture medium (DMEM+10%FBS+1%PSA) 隔天用螢光顯微鏡觀察GFP表現,看到的螢光量大概是有80~90%以上。 2. 使用的3個plasmid確實都用enzyme check過,理論上是沒問題的。 3. 293T細胞是從中研院RNAi core lab要來的。 Day1: seeding 293T cells (~60%) in 6-well plate. Day2: transfect 3 plasmid: CMV 0.9ug MD.G 0.1ug shRNA or GFP 1ug ---------------------------- 2ug in 100ul OPTI-MEM + Trans-LTI 6ul in 100uL OPTI-MEM | | mix, incubate 20~30mins,RT | 　　　　　　 V 將200ul DNA/LTI mixture加進細胞中 Day3: 換含1% BSA的culture medium 1.5ml Day5:(48hrs) 離心,收Virus。請有經驗的朋友幫幫忙,我快被老闆追殺了,謝謝。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 163.25.118.180

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ranilla

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ranilla

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spermwarm

04/09 09:45, , 3^F

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