Re: [求救] 關於NCBI網站的使用方法
如果是要作degenerate primer
建議可以在NCBI裡找尋你要作的物種的類似物種
是否已經有序列被發表出來
例如你想作蜜蜂 就去找其他昆蟲類或是節枝動物類同一個基因的序列
然後把找到的這些基因一起作比對
找尋相似度最高的區域
如
大黃蜂 !!@#$$%%^^&$ATCCAATAGGTA!!#@##%$^%^^&*^CCTTATAAT!#@#@$$#^%$&%
螞蟻 @$#@$$%%$^%&ATCCTTTAGGTA@#$#$%%$^%$^%^&CCGGTTAAT#@$#^$%^%&^*(
蜘蛛 @$%#$^%%&%%**^*ATCCGGTAGGTA/$%^&&*(^$$$%CCCCTTAAT@$#$^%&^*&*(*)&*(((
蚊子 #$^%^*&*(*^&%$%ATCCTTTAGGTA#%^$%&^*&(^&&&$%&*CCAGTTAAT%%^%%%%&
瓢蟲 #%^%&^*&^^#ATCCTTTAGGTA#%$^&%^^&^&*^&^CCGATTAAT^%^$%$^&^%%%%%
這時候可以發現有某些區塊是相似度很高的
就把這些區塊抓出來設計primer
以上述為例 我會選擇 ATCCAATAGGTA 和 CCGGTTAAT這兩個區塊設計
但把其中有變異區域以N代替
最後所得到的degenerate primer即為 ATCCNNTAGGTA 和 CCNNATAAT
因為要clone未知片段
所以僅選用單一生物種的基因設計degenerate primer風險較高
故而還是用近似物種比對後的結果 可以成功的機率較大
利用這對 primer所得的片段 如經定序分析後
所得結果與其他物種同一基因之相似度甚高
即可利用此一片段進行5'及3' RACE 就可選殖到你想獲得物種的此基因全長了
這時候你就可以把它upload到genebank 就會得到一個新的acession no
而NCBI上也會留下你的大名的 呵呵
這樣有幫你把作業完成吧?
※ 引述《ftsyice (Matt)》之銘言：
: ※ 引述《mitchlai (mitch)》之銘言：
: : 假設你要進行大象(pyruvate dehydrogenase)之研究,且該之該酵素胺基酸序列及DNA序列
: : 均未知,請由網路資料庫現有之資訊設計退化性引子,並說明如何應用在PCR方法求得該基
: : 因之全長序列.
: : 我只知道去NCBI的網站找~, 在 search 的欄位選擇 gene 這一選項嗎?
: : 那FOR 是要打pyruvate dehydrogenase??還是什麼?接下來又該怎麼做?
: : 請會的人告訴我~
: : 謝謝~感激
: 1.)
: gene輸入pyruvate dehydrogenase
: 選取你要的基因，點入。
: 中間有一欄為Genomic regions，選取你要的Form
: 點選FASTA，會出現基因序列。
: 選擇NCBI中的BLAST
: 將FASTA裡的序列複製到Primer-BLAST or Primer3網站
: 點選，電腦就會幫你把Primer設計出來
: 2.)
: 將電腦做出的Primer再去和其他Isoform或別的物種的相同基因進行BLAST
: 因為要的是degenerate primers，我們希望都能抓其他相似基因。
: 3.)
: 以上順利的話，把此段Primer，去抓你未知的DNA序列。
: 順利抓到的話，再做Inverse PCR應可知道此基因的序列。
: PS
: 術語盡量用英文，退化性引子我第一次聽到。
: NCBI中找到的序列，可以取變異性較小的片段來做Primer。
: 以上是我推論的，可行性不知，有錯請指教。
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