Re: [討論] 有關大腸桿菌表現系統的問題?
※ 引述《charlielg (chi)》之銘言：
: 1.大腸桿菌是目前表現外源基因最常用的系統,然而大腸桿菌表現系統常遇到
: inclusion body的問題,他是一種不可溶物質,這裡所謂不可溶是指不可溶於水
: 還是不可溶於任何溶液?
其實不可溶物質這句話就有點怪怪的 因為還是可以藉由強烈的還原劑讓蛋白質溶在水中
比較偏向inclusion body這個大分子集團在細胞液中是不可溶 但protein則不一定
: 2.inclusion body是因為構型摺疊不正確而使其變成一種不可溶物質,因而造成活
: 性不佳,那是否當inclusion body變成可溶性也就代表活性會提升呢?
inclusion body形成我覺得可以分成幾個方向來討論
第一個是protein在E.coli中是可以被正確folding
但是因為製造速度太快 在folding的嘗試過程中會因為分子間的距離太近
使得數個protein分子的hydrophobic domain互相黏在一起變大分子團
這種情況下我想降低溫度或IPTG濃度避免inclusion body 之後產生的protein活性會提升
第二種是在E.coli中無法正確folding
分子量太大或者太複雜導致怎樣嘗試都無法正確folding
或者E.coli的chaperone不賞臉不想幫 disulfide bond也不賞臉
O/E的protein hydrophobic domain一堆 Charge也一堆
這種我想就算想辦法讓他不要形成OB 但是做出來的protein也沒function
第三種是O/E的protein對E.coli有cytotoxic所以把它聚集起來
這種讓它不會形成OB..就換成E.coli死給你看
: 3.利用大腸桿菌來表現真核基因時,所表現出來的蛋白質會跟native form會差很多
: 嗎?如果會,那為何在很多實驗中還是要利用此系統呢?除了此系統便宜培養容易
: 及了解較深入之外,有其他考慮因素嗎?
我覺得是要考慮到實驗用途............(還有老闆的財力)
假如O/E的蛋白沒有太多的disulfide bond和太複雜的結構就用E.coli
需要多disulfide bond 微量phosphorylation就用Yeast
再需要多phosphorylation 微量Glycoslation就換Insect
要全部功能就用Mammalia cell =口=b
假如要研究的只是某個domain或motif也不需要用到full protein表現 就單純用E.coli
弄出那部份就好
(或者黑暗一點的.. 用full protein native form做出來是沒結果 科科)
或者在解結構上來說 上述那些post-translation modification會造成更難解析的結果
那到不如找個E.coli可以輕鬆拿到 又不會有太複雜後修飾的來搞
: 4.此系統最常被用來表現哪一類的外來基因(哪一類的蛋白質)?
: 以上這些就是本人疑惑之處,希望這方面高手能為小弟提供點意見,感激萬分!
我不是高手 所以也希望有人可以訂正或補完 v(￣︶￣)y
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