Re: [求救] Southern的問題
※ 引述《owl628 (owl628)》之銘言：
: 最近學用DIG合成probe去做Southern
: 但是壓出來的結果有很多雜band
: 而且major band並不是我要的band
: 想了一下如何降低background
: 想到
: 1.增加probe長度(原本是500bp)
: 2.增加pre-hybridation的時間(原本是一小時)
: 3.增加wash的時間跟溫度
: 註:上述條件大部分是照Roche的kit做的
: 想說板上有沒有人有類似的問題
: 不知道除了我舉的那三點還有沒有哪裡可以改進
: 或是那三點改進有用嗎???
: 麻煩大家了,謝謝~
首先 southern 真的是超難做的實驗, 好吧 其實是繁瑣 正沖我的急躁
過程是重重考驗~ 科科 ~ 所以第一個建議是.....別急...一步步紮紮實實往下作
--------------------------------------
實驗部分:
1. 南方轉漬 要注意的有
a. DIG labeling band shift是不是有符合預期,DIG-dU的比例 (PCR法)
如果吃飽太閒有人甚至還會純化過 科科
b. DNA的脢切~影響脢切的因素有沒有排除, 切完之後的 DNA ladder...等等
c. 架鹽橋之前的buffer wash ..... 淦 I hate those so much.
(切記...用那種membrane就根據原廠建議的buffer濃度)
以上請自行確認~並小心操作
--------------------------------------
根據您的敘述 我認為
背景值除非深到影響判讀~ 否則....跟結果不符預期是兩回事
背景太深...跟probe長度 或 pre-hy時間 我認為 無關
跟 probe loading 的量, wash的條件,與曝光時間長短 有關
probe 該下多少 請參考羅氏說明書<<<<大本的那種,上頭好像還有隻青蛙照片
該用怎樣的條件wash, molecular cloning 有寫
曝光 就交給機器吧~ 我是用CCD偵測+電腦控制>>data 是 jpg or tif
所以我都放心的出去玩 科科
至於與結果不符預期~我認為...
如果不是DNA沒切好
大概是..................anyway...就在重頭推算一次
搜尋一下probe的敘列
搞不好 probe內含一段太過於保守的片段 以致亂粘
可能您後來會嚇一跳 目前的結果 其實是*可以 符合預期的*
所以~ 雖然我認為500bp 應該是夠了~ 但是probe搞長點~應該也不賴
總之再次確認之後 您自然會有所取捨
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 118.171.15.86
→
08/19 15:46, , 1F
08/19 15:46, 1F
→
08/19 15:48, , 2F
08/19 15:48, 2F
推
08/20 12:42, , 3F
08/20 12:42, 3F
推
08/21 12:37, , 4F
08/21 12:37, 4F
討論串 (同標題文章)
本文引述了以下文章的的內容：
完整討論串 (本文為第 2 之 2 篇)：