[求救] TA cloning一直失敗.....

看板Biotech作者 (owl628)時間16年前 (2008/06/04 11:44), 編輯推噓12(12推 0噓 14→)
留言26則, 10人參與, 最新討論串1/3 (看更多)
我用的是invitrogen的TOPO TA Cloning 用Tag P出我的要的片段,約1800b.p 加4ul和1ul的salt solution及1ul的TA vector作用 (22度西 30分鐘) 接著用自己做的competent cell(DH5α)做CaCl2 transformation 結果做了快10盤,不是沒長,就是長的colony抽不出質體 (養的時候感覺菌液就不是很正常,有點稀) 抗生素Ampicillin及Kanamycin都用過了 不知道有沒有人可以給我個建議,麻煩大家了 謝謝~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.128.139.218
推
06/04 11:48, , 1F
有確定過抗生素抗性還在後？
06/04 11:48, 1F
→
06/04 11:52, , 2F
有的,抗生素沒有問題,competent cell其他人使用也OK
06/04 11:52, 2F
推
06/04 13:04, , 3F
heat shock 後, 有做recover?
06/04 13:04, 3F
推
06/04 13:13, , 4F
可以看兩個地方 一個是用剛做好的PCR產物
06/04 13:13, 4F
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06/04 13:14, , 5F
另一個做transformation大約只加兩ul反應到50ul的細胞裡
06/04 13:14, 5F
推
06/04 14:46, , 6F
TA時可以作用久一點 我有時還放O/N @@
06/04 14:46, 6F
推
06/04 15:51, , 7F
or 16度c o/n
06/04 15:51, 7F
→
06/04 18:50, , 8F
heat shock後recover一小時.ligation product一共有6,我拿
06/04 18:50, 8F
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06/04 18:51, , 9F
一半Transform.還有因為vector說明書上說5到30分鐘就夠了,
06/04 18:51, 9F
→
06/04 18:52, , 10F
請問有需要到o/n嗎?非commercial的vector我才會o/n,謝謝^^
06/04 18:52, 10F
推
06/04 19:47, , 11F
PCR的產物有確認是單一band嗎?純化後的濃度?
06/04 19:47, 11F
→
06/04 22:13, , 12F
有跑過膠確定過,濃度沒有測,但是應該滿多的.
06/04 22:13, 12F
推
06/04 22:28, , 13F
會不會kit有壞掉？ 其他人用這個做TA一樣沒問題？
06/04 22:28, 13F
推
06/04 22:55, , 14F
heat shock 溫度 時間, 處理完要養一小時比較好
06/04 22:55, 14F
推
06/05 02:20, , 15F
你的PCR產物有做gel extraction嘛?有的話可能是這裡有問題
06/05 02:20, 15F
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06/05 02:22, , 16F
有的gel extraction kit不適合拿來作TA或ligation
06/05 02:22, 16F
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06/05 02:23, , 17F
可以試著不要纯化PCR產物　直接作TA 不過效率會比較低
06/05 02:23, 17F
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06/05 10:04, , 18F
heat shock時間兩分鐘,42度西.處理完有養一小時
06/05 10:04, 18F
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06/05 10:04, , 19F
我是有做膠回收,會是這裡發生問題嗎???謝謝大家^^
06/05 10:04, 19F
推
06/05 19:47, , 20F
PCR→PCR clean up→Ligation(RT,1hr或16度C O/N)
06/05 19:47, 20F
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06/05 19:47, , 21F
→Transformation
06/05 19:47, 21F
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06/05 22:11, , 22F
可以請問做膠回收跟PCR clean up的差異在哪嗎???謝謝大家~
06/05 22:11, 22F
推
06/05 22:17, , 23F
我也想知道差別？？？ 不過要做下面ligation的步驟
06/05 22:17, 23F
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06/05 22:17, , 24F
請用水elute
06/05 22:17, 24F
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06/05 22:19, , 25F
我是用水elute沒錯,謝謝~
06/05 22:19, 25F
推
06/06 02:21, , 26F
個人認為PCR clean up的回收率會比較高 也比較快
06/06 02:21, 26F
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