[問題] 關於real-time PCR的問題

看板Biotech作者 (沉澱)時間16年前 (2008/03/25 22:18), 編輯推噓10(10推 0噓 9→)
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※ [本文轉錄自 Bioindustry 看板] 作者: candy315 (沉澱) 看板: Bioindustry 標題: [問題] 關於real-time PCR的問題 時間: Tue Mar 25 22:09:47 2008 各位大大好，我是某大學的碩士生 我想請教關於real-time PCR的問題 大部份的實驗...都會用RNA轉cDNA然後再做real-time PCR 但我的template是genomic DNA 也有聽說genomic DNA的real-time比較不好做.. 然後，一個大問題來了 我們老闆說，primer的量通常是總體積的1/10左右 所以我先用一般PCR在測試primer時，我是用5uM的primer，然後每管取2.5ul (total volumn為25ul) 但做real-time時，因為我陰錯陽差的失誤 一直以來，我都是用5um的primer，然後每管加0.25ul (total volumn亦為25ul) 我想請問大家，有人用過這麼少量的primer嗎?? 因為我的實驗其實已經快結束了...如果我之前的primer量真的加的太少， 那我可能所有實驗要重做了....orz 所以我想請問各位有經驗的大大，有人也是和我一樣，用類似的量做real-time PCR的嗎 PS，我用的kit是 SYBR的kit -- * Black Angel* http://www.wretch.cc/album/blackkk -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 203.64.80.19 -- * Black Angel* http://www.wretch.cc/album/blackkk -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 203.64.80.19
推
03/25 22:30, , 1F
250 nM 很正常的濃度，我倒是建議你別取0.25 ul那麼小的體
03/25 22:30, 1F
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03/25 22:31, , 2F
積。稀釋10倍取2.5ul比較準確
03/25 22:31, 2F
推
03/25 22:35, , 3F
不太正常吧? primer final conc是50nM 之前測過primer濃度
03/25 22:35, 3F
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03/25 22:36, , 4F
謝謝A大給我的答案..我是把SYBR和primer配cooktail，
03/25 22:36, 4F
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03/25 22:37, , 5F
所以其實沒有取小體積的問題^^，不知道A大手上有沒有ref
03/25 22:37, 5F
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03/25 22:37, , 6F
也是primer加250nM左右的...我想拿來說服老闆..
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03/25 22:37, , 7F
好像至少都要超過100nM　CT才會穩定 不過做的是普通的DNA
03/25 22:37, 7F
推
03/25 22:41, , 8F
J Clin Microbiol. 2004 July; 42(7): 3281–3283.
03/25 22:41, 8F
推
03/25 22:41, , 9F
不過全部重做之前 可以先把primer濃度做序列稀釋跑跑看
03/25 22:41, 9F
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03/25 22:44, , 10F
不好意思，我算了一下..C大算的好像才是對的
03/25 22:44, 10F
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03/25 22:44, , 11F
看來我的primer好像真的加的過少....orz
03/25 22:44, 11F
推
03/25 22:46, , 12F
如果沒影響就不用重作啦
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03/25 23:23, , 13F
你再做一次比看看就知道啦~~
03/25 23:23, 13F
推
03/25 23:27, , 14F
測100~500nM不同的primer濃度 每50nM為區間 找CT低的用
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03/25 23:43, , 15F
(5*0.25/25)x1000 = 50nM 他的濃度是 50 nM沒錯
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推
03/25 23:48, , 16F
在ABI的建議中是100~300 nm不過如果對比出來OK就算了吧
03/25 23:48, 16F
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03/25 23:49, , 17F
Realtime的東西好貴啊～～～(今天又化了好幾萬 >_<)
03/25 23:49, 17F
推
03/28 11:00, , 18F
可以先看melting curve看跑出來的螢光是不是正確的~
03/28 11:00, 18F
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03/28 11:02, , 19F
real-time的東西很貴~確認好有需要在重做吧~
03/28 11:02, 19F
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