[求救] 有人做過5' RACE PCR嗎?
最近在做5' RACE PCR
用的是Roche 5'/3' RACE kit
我先用一個reverse primer 1 (R1)將RNA轉成cDNA後
再讓cDNA接上poly A tail
之後再用oligo-dT anchor primer與reverse primer 1(R1) and 2(R2)去做PCR
結果到這邊只有出現primer dimer
之後老闆要我再做一次nested PCR
就是用PCR anchor primer與reverse primer 2 (R2)去跑
結果反而出現smear的現象
第一次的PCR product也照kit protocol寫的做了1:20倍的稀釋
還是一樣出現smear的情形
請問一下有人做到5' RACE PCR嗎?
實在不懂哪裡出了問題 是RNA轉cDNA部分沒做好嗎?
因為原本懷疑是在cDNA接上poly A tail這邊的問題
結果重新做了一次還是一樣
kit上面說可以直接用oligo-dT anchor primer與reverse primer 2
就可以直接夾到所要的片段 真的可以這樣就做出來嗎?
我們家老闆說不可能 那這樣還要anchor primer幹麻
拜託有沒有做過5' RACE PCR的人可以幫我一下 謝謝~
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