我把你文章重排了一下 比較好回答
※ 引述《bluecsky.bbs@ptt.cc (我要藍藍淡淡的天空)》之銘言：
> 請問western blot中secondary antibody使用過多
> 會造成許多的bnad嗎?
> 因為我是第一次用這個secondary antibody(sigma的anti-rabbit IgG HRP)
> 一時找不到手冊又很趕的情形下..
> 不加思索的使用1:10000的稀釋下去做...
> 結果後來才想到網路上就能找了= =
> 結果說明手冊說建議1:160000...哇靠..整整差了10倍
> 沖片出來的結果也很怪
> 好像..band有點多..
欲速則不達 這是我的經驗談
為了快 該作的 control 沒作 最後一定倒大霉
建議拿到新的 2nd Ab 之後要先作一次不加任何 primary Ab 的 control
確認一下 background 的狀況先
> 還有..要是我真的secondary antibody用太多
> 除了重做以外還有救嗎= =..
如果你的 sample 真的很珍貴
可以試試看 strip 以後重作
http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/Protein/Western_Blotting/S
tripping_Western_Membranes/
雖然個人還是建議重作比較好
> (不過這次用的primary antibody..lab中學長沒有使用成功過..也就是用了沒有band出來)
> 我還滿害怕我的結果會不會是因為我secondary antibody過多造成的...
有沒有試過去認 overexpressed protein?
如果 overexpress 的都認不到那這支抗體就根本不能用啊
如果可以 那才可能是靈敏度的問題
> 還有..做回來的antibody的specific都大概會是怎麼樣..
> 因為之前大多做的是直接買的(GST..His-tag等)
> 這次做的是由前人純化的protein去打兔子出來的
> 拿到是一整管類似血的東西(應該是血吧..)
> 這樣做的specific會不會有影響?
應該是血清
我不知道你說的 "有影響" 是什麼意思
抗體百百種 每一支的特性都不同 一定要測過才知道
絕對不可以先假設各種抗體都一樣啊
比方說你有一個含有 1. his tagged protein X 的樣品
以及直接購買的 2. anti his Ab 還有打兔子打出來的 3. anti protein X Ab
如果你用完全一樣的 protocol, 用 2. 或 3. 染 1. 得到的結果幾乎一定會不同
--
And my soul from out that shadow that lies floating on the floor
在那地板上浮動的影子中的我的靈魂
Shall be lifted- nevermore!
將永不再起...
--The Raven by E.A.Poe
--
※ Origin: 生命科學 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw>
◆ From: cpe-66-61-25-6.neo.res.rr.com
推
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求救
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