[求救] PCR,以前做的出來,現在做不出來了?

看板Biotech作者 (愛自己最重要)時間18年前 (2007/10/24 16:43), 編輯推噓14(14推 0噓 7→)
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請教版上的PCR高手們, 我目前做的題目是關於細菌的基因, 我做的是陰性菌,目前在檢測細菌中是否帶有特定的基因, 這個實驗在今年二月做過一部份,結果良好,一切都沒問題, 因為之後收到更多的菌株,因此在九月時又重新進行此實驗 結果非常慘,再也跑不出來了! 連之前二月做的陽性菌株,現在也無法跑出我要的產物 原先懷疑是PCR的問題 所以目前試過3家dNTP,4家Taq, 調整過鎂離子濃渡由1.5mM試到2.5mM,結果連水都出現偽陽性 改變annealing的溫度下降2-4度 都無法再度amplify出正確產物, 後來又懷疑是否DNA有問題, 又重抽DNA兩三次 (使用過phenol/chloroform/Isoamyl Alcohol的方法也試了用kit抽DNA) 還是沒辦法Orz 目前還沒試的,只剩下加DMSO了 (等會就知道結果了T_T) 可是我二月時不加DMSO也可以跑出來呀~~~ 有人可以再給我不同的建議嗎? 試了快兩個月了,再做不出來,我真的可以不用玩了Q_Q -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.96.207
推
10/24 17:01, , 1F
primer是新的還是舊的/ 要不要換另一組primer試試
10/24 17:01, 1F
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10/24 17:02, , 2F
假陽性的產物 有定序過嗎? 二月的產物有定序看過序列嗎
10/24 17:02, 2F
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10/24 17:12, , 3F
忘了說,primer有重新合成,新舊primer都試過
10/24 17:12, 3F
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10/24 17:15, , 4F
二月產物有定序,是ok的,偽陽性無產物太弱,無法定序
10/24 17:15, 4F
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10/24 17:25, , 5F
如果我是你 我會換不同位置的primer來試
10/24 17:25, 5F
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10/24 17:26, , 6F
另外 做southern試試? , PCR水夠乾淨嗎? 用隔壁的PCR機器
10/24 17:26, 6F
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10/24 17:43, , 7F
謝謝你的建議,我明天會試另一組primer--之前試了一次是失敗
10/24 17:43, 7F
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10/24 17:44, , 8F
PCR水應該是ok的,我們家實驗室有好多台PCR機器,我應該都用了
10/24 17:44, 8F
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10/24 17:48, , 9F
PCR buffer 壞了? 有這種問題我都reagent含水全部換掉
10/24 17:48, 9F
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10/24 17:49, , 10F
很多因素會使得PCR發生問題而作不出來,先用作得出的人的東西
10/24 17:49, 10F
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10/24 17:50, , 11F
再作一次看看吧! 當然如果你時間很多,一項項試誤找原因也可
10/24 17:50, 11F
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10/24 17:50, , 12F
我試了四家Taq,buffer都有跟著換
10/24 17:50, 12F
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10/24 17:51, , 13F
找作得出來的人協助看你問題出在那!
10/24 17:51, 13F
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10/24 17:54, , 14F
dNTP有可能壞了,可拿別人可以work的dNTP試試
10/24 17:54, 14F
推
10/24 18:37, , 15F
加DMSO的結果出來了~失敗Orz...而且今天是別人幫我試的結果
10/24 18:37, 15F
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10/24 18:40, , 16F
這組primer可能沒救了吧....Q_Q
10/24 18:40, 16F
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10/24 18:53, , 17F
換primer比較快啦..換不同序列的 機會比較大
10/24 18:53, 17F
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10/24 22:25, , 18F
dNTP的濃度是對的嗎？ 我剛進實驗室時一直拿十倍的～
10/24 22:25, 18F
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10/24 22:25, , 19F
做超久都做不出來 （好險老闆沒生氣）
10/24 22:25, 19F
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10/24 22:43, , 20F
鎂離子濃度也不可過高...會影響dNTP作用~我實驗室學長就是
10/24 22:43, 20F
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10/24 22:45, , 21F
多加了鎂離子..作了很久都做不出來!最後降低鎂離子就出來了
10/24 22:45, 21F
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