Re: [問題] 什麼時候用NMR什麼時候用X-ray解結構？
我們實驗室是做蛋白質結構的
想分享一下從老師那裡和自己的實驗心得 ^^
[如果不符合版規請版主不用客氣^^"]
※ 引述《timbrian (perk yourself up)》之銘言：
: ※ 引述《ronall (暱稱小公主的!扣十分先)》之銘言：
: 稍微修飾一下 文章會更完美
: : 就我所知的說一夏
: : 我是化學所的生化組
: : 我做的是蛋白研究
: : 理論上而言
: : 我盡可能希望獲的蛋白的NMR圖譜
: : 因為NMR適用於水溶液的環境
: : 對於bio而言
: : 這點是非常重要的關鍵
: : 因為僅有在這樣的條件下
: : 才能說是看見蛋白在生物體中的真實結構
: 首先 沒有一個很嚴謹的結構生物學家會那麼肯定說他所解出的結構
: 就是生物體中的真實結構
: 無論是 X-ray, NMR, EM 都是在in vitro 的條件
: 且各有其嚴苛的條件下所做出的結構
: 這些離生物環境都很遠
: 做cell bio 或 biochem 的人也很少說他們做的就是為 in vivo的真實情況
完全同意 t 大
過去的確也有 paper 比較在 X-ray 和 EM 下的結構的確有差異
可以發現某些蛋白質堆疊的面的結構受到壓縮
水溶液環境下 NMR 的結構的確有可能較接近生理條件
但是也有很多 paper 會引用蛋白質結晶仍具有其活性的 data 來證明其結構的真實性
[我想到的是 lysozyme XD]
所以誠如 t 大所言
沒有一個被解出的結構可以說就是真實的結構 [測量就會有誤差嘛 (笑)]
不過畢竟這些結構不是人親眼所見
科學家只能用其他實驗方法佐證實驗結果的正確性
: : 而X-Ray
: : 在檢測前有個前提
: : 就是必須養晶
: : 無論是哪種蛋白
: : 通常在養晶時必須加入一些重金屬作為晶核
: : 或是與蛋白敖合形成晶種
: : 即便有不加入重金屬而養晶的方式
: : 都無法比NMR方式肯定的說
: : 這是在生物體中較為真實的存在結構
: : 但NMR檢測也是有缺點的
: : 就是必須相較於X-Ray而言
: : 必須要有相當程度的濃度才能檢測
: X-ray 所須濃度與 NMR 所須濃度是 case by case
: 都不低 難比誰高誰不高
X-ray 解析結構受限於養晶 [淚推~~~~~]
不過養晶的過程中就算需要加入重金屬也不是要作為晶核
如果想要解出結構的蛋白質已經有類似的結構被解出
在得到繞射點數據後可以利用一些軟體 (CCP4) 以 MR 的方式解出
如果是完全沒有類似結構 就會需要利用重金屬當作參考 (啊好複雜@@)
有的時候也會利用 Se-Met 所以不一定會需要使用重金屬
至於濃度上的問題
t 大說的真是令人感動 @@
真是 case by case
不過如果可以準備多點蛋白質 均質一點 可以得到較好的結果
: : 而通常
: : 我們盡可能使用N label (N同位素標定)的方式檢測
: : 但是硬是要養出被同位素標記的蛋白通常都是不容易的
: : 因為是屬於強迫性的方式供給菌種極為少量的養分
: : 迫使菌種吸收同位素生產蛋白
: : 因此產率通常都很低
: : 此外
: : 蛋白是種大型分子
: : 因此通常低磁場的NMR圖譜是不能看的
: : 在我的實驗室中
: : 都是送到我學校的NMR 600MHz 貴儀中心進行2D NMR檢測
: : (國內學校單位有這樣的機型的不多見)
: 國內 800MHz 就 NCHU 與 GRC 吧
: : 而X-Ray在樣品的製作上是容易的許多
: .........................
嗯.... r.d.s 不一樣吧?
在之前還沒有實戰經驗的時候
我一直以為 純化蛋白質是最痛苦的 @@
後來發現養晶更是一種煎熬 @@
然後有機會上機的時候又發現
就算晶長出來了 繞射點也不見得好 [爛爛的繞射點俯拾即是 Orz]
所以我覺得這也是 case by case
解析結構真是門藝術 @@
: : 解析通常也不錯
: : 但是唯一為人所詬病的就是
: : 這樣的結構並不是存在於水溶液環境底下的
: protein crystallization 並非是不含水的
: 蛋白質晶體晶格中常含有 30~70% 水分子
: 只是有些 PDB file 中省略掉了
: 甚至可以說蛋白質結晶是固像的水溶液的
: 沒有水的蛋白質結構不大可能是正確的
: peptide 一定跟水有某方面的作用力
: 是否為水溶液並非 X-ray 問題的核心
: 真正有問題的
: 當然有時蛋白質結晶在較嚴苛環境下 (如高鹽, 較極端 pH 質...等等)
: 結構可能與生理有些出入-----------*
: 但只要有結構 仍有其參考度的存在
: 此外 常常有 map 不見的情況發生
: 這些 map 不見的區域也常為蛋白質有其 function 重要的區塊
: 當然 dynamic 狀態 information 不足也為其 X-ray 結晶學的重要缺點
: 當然還有很多很多問題 就不一一說明
: *注 : 這句話也為一個伄詭 既然沒人能說何為生理環境的真實面貌
: 當然也只能以現有 data 為解釋
不能同意 t 大更多
也正如我前面提到的
這個部份也是結構生物學家爭論不已的
不過也因為提出過實驗數據 證明就算是結晶狀態下的蛋白質仍具有活性
但也不能否認 r 大所說的 不是水溶液下的確很令人詬病
只是 X-ray 結構解出的時候 如果完全沒有水分子那這個結構大概也不可信吧
不過 PDB file 中並沒有省略掉水分子
只是用來開啟 PDB file 的軟體有沒有顯示出來
不然直接使用記事本開啟 PDB file 檔的時候
一定可以看到水分子的空間位置座標
而 t 大提到真正的問題
我想其實可以在拿到結晶的時候省視一下結晶條件
或是在篩選養晶條件是會略過過於嚴苛的環境
這樣都可以提高所得到 X-ray 結構的可信度
map 看不見 常是因為該區的 flexibility 太高
如果說是酵素的 active site 則常會使用 substrate 的 analog 來穩定過渡結構
或是做一些 point mutation 來改善
雖然說還有很多很多的問題
不過就像 t 大所說的 無法一一說明 或許這也是我們該回答的問題 XD
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: 早期認為若把所有生物分子結構解出來
: 生物學就到底了
: 其實很多問題的開端 正是等結構解出來了後才又蹦出一堆來
: 生物分子的交互作用 四級結構的變化 post-translational modification
: 條控 等一堆都還要各領域的投入
: 結構只是工具
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: 還有 即便是結構的 paper , 也不要全信 paper 內所提的所有論點
: 雖說做結構的人會說眼見為評
: 但同一個結構 不同的解釋有時會差的天差地遠的
: 光我們自己發表的結構 內部就有不同的意見
: 這些很多在文中都不會說的
同意 t 大的說法
解出一個結構通常都會花掉的都是很多很多的錢
如果把分子結構解出來就當成一個結束實在是很可惜
應該好好利用其他的實驗方法 將這些結構的結果用以參考
結構只是輔助 不是個終點~~
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做結構的人越來越多了~~
不知道可不可以開個版來分享一些實驗心得??
台灣有很不錯的 NSRRC 的光源可以利用
真希望可以有更多有經驗的人分享實驗心得~~~
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尋找在程式中片刻的寧靜...
我願能將心靈沈澱 結晶...
讓晶體一點一點散發淡淡的濃純香郁...
送給單純的你 祝福
找到屬於自己最原始的愛戀...
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