[問題] IP無法將antigen elution 出來

看板Biotech作者 (黑特版比就可版好笑)時間17年前 (2007/07/01 18:46), 編輯推噓4(4推 0噓 7→)
留言11則, 3人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
各位版友大家好 最近在做IP 第一次做對照組的時候有成功 但是在開始進實驗組的時候 卻發現無法將antigen elution下來 也就是說利用western在Cell lysate中有 但是flow through 以及wash跟後續的elution都沒有!!! 怪哉 我用的是Pierce的kit 其中有一個步驟 是利用DSS將antibody與protein A cross-link 本來老師是說有兩種可能 第一種可能是elution buffer pH不對 第二種可能是DSS沒有wash乾淨 我將elution buffer以pH試紙測試的結果發現在2.9-3.1左右 差不多是3.0沒有錯 在去除DSS作用的這一個步驟 原本kit中建議利用elution buffer wash六次 再以wash buffer wash四次 我把他提高到elution buffer 12次 wash buffer 10次 照理說應該是已經將多餘的DSS wash了才是 但是結果卻還是發現沒有辦法elution 出來.... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.109.32.9
推
07/01 20:00, , 1F
elution出來之後的實驗是?
07/01 20:00, 1F
推
07/01 23:28, , 2F
回樓上 做western看Co-IP結果
07/01 23:28, 2F
推
07/02 00:51, , 3F
western blot不需elute...加2x sample buffer去煮直接跑
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07/02 00:52, , 4F
我都這樣跑....OK的啦！紙不過well可能得做深一些
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07/02 00:53, , 5F
band也很漂亮，無須擔心其他問題
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對了，我是說連beadsㄧ起loading歐
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推
07/02 00:54, , 7F
我猜原po是想做出可以reuse的beads，所以不能直接放
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07/02 00:55, , 8F
sample buffer下去，而改用low pH buffer去elute...
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07/02 00:56, , 9F
不過在將antibody cross-link到bead上面之前，還是先作個
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單純只有bead+Ab+antigen的實驗去check這個Ab是否能將
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抓下來。此外用NHS ester的cross-linker容易讓Ab失去效力...
07/02 00:57, 11F
之前用wild-type的cell lysate做過 雖然說是已經cross-link的antibody-protein A 但是實驗結果是可以work的 只是重新make antibody-protein A beads 不知道為什麼又不能work了.... ※ 編輯: Bluecold 來自: 140.109.32.9 (07/02 11:46)
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文章代碼(AID): #16XuNrOj (Biotech)
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