※ 引述《dropdred.bbs@ptt.cc (keep the faith)》之銘言：
> ───────────────────────────────────────
> 最近要做long range PCR
> 想請問大家哪一家的Taq比較適合做long range PCR
> 是不是有proofreading...
> 也請大家提供點意見
> 沒夾過500bp以上的說...有點給它害怕
> 夾個10K成嗎?
> 平均成功的機率多少
> 我要夾human genomic DNA說...
> 感謝大家的大力協助...
1.target DNA的copy number要夠多(1 microgram)一定做的出來,且quality要好!
若copy number確實不太夠,可添加BSA(cosolvent)會有所幫助!
2.可使用hot start 的方法,比較specific!
3. polymerase要選擇processivity較長的!pfu就比Taq好
或者可以使用mix的polymerase(Taq+pfu),可以選購mix的產品!
4. 可添加cosolvent to assist denaturing complete ,如10% DMSO
另外可以加pyrophasphatase它能將phosphate分解可促進反應的進行!
5. cycling parameter中, denaturating and extension的反應時間要夠長!
denaturating--> genomic DNA:5 min; plasmid DNA:2 min
extension-->一般taq:1kb/min;所以根據你欲amplify的10K就要用最少10 min
掌握這些原則做看看,希望能對你有所幫助!
有人最多有amplify出19.6K的啦!
10K應該ok ok
good luck!
--
╭─ Origin ─╗ 新綠園 bbs.sa.ncyu.edu.tw ～ κλμ ─┤
├ Author ╡ 177206.MBB.ncyu.edu.tw
討論串 (同標題文章)
完整討論串 (本文為第 2 之 2 篇)：