Re: [問題] 請問用western blot偵測磷酸化蛋白
※ 引述《fodo (fodo)》之銘言：
: 請問使用western blot偵測phosphorylated protein kinase時
: 每次跑出來的結果很不穩定，有時候可以看到磷酸化現象，有時候又看不到
: 不知道是在那個步驟出了差錯？
請問你是要detect cellular protein phosphorylation
還是IP kinase來進行kinase assay
可以講詳細一點嘛
還有你用的抗體是染啥
染protein還是染phospho-Y(phospho-S/T)?
還是特別染phospho-specific residue on kinase?
: =============================================================================
: 自己覺得可能發生問題的地方
: [1] lysis buffer成份
: 我所用的RIPA buffer為(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.5mM EDTA,
: 1mM DTT, 1% NP-40, 0.5% Sodium Deoxycholate,0.1% SDS)
: 使用前外加 protease inhibitor和phosphotase inhibitor
: 這個配方是kinase activity assay kit裡面裡面建議的RIPA配方
: 但是又有看到有資料上寫說進行kinase assay時不可加入Sodium Deoxycholate
: 不知道是不是我加了什麼不該加的東西呢？
: [2] SDS干擾
: 會不會因為SDS-PAGE裡面的SDS把所有蛋白都加上了負電，
: 如果要看的蛋白分子量太大，多了一個磷酸根跟沒有多磷酸根，將無法被分辨
: 我要看的蛋白是Src kinase(~60kDa)和ERK(~42kDa)
: 這兩種蛋白需要跑non-denature gel嗎？
這是不需要的
不用擔心
: 查paper作磷酸化很多人也是用SDS-PGAE在跑
: [3] 溫度影響
: 收完cell lysate後，每100ul加入2.5ul的β-mercaptoethenol，100℃煮10 min
: 每次要跑膠前再煮100℃ 2 min
: 這樣會boiling過頭嗎？ 莫非磷酸跟會煮一煮就掉下來嗎XD
covelant bond沒那麼弱
不用擔心
: 我是實驗室第一個作磷酸化實驗的
: 作了好幾個月都一直這樣若有似無
: 不知道一般作磷酸化還有哪些地方是影響結果關鍵的步驟
: 想請各位有經驗的學長姐提供我可以改善的地方
: 謝謝各位^^
你可以講詳細一點
包括你的目的，使用的materials 和tools
這樣比較好給意見
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