小妹很久沒有做了
最近開始做 要做的是cKit (RTK), AKT and ERK
我使用的lysis buffer 之前都沒有問題
最近不知道怎麼好像出了問題
我在二月初有做一個sample as positive control 我收細胞wash
之後用lysis buffer 4C shake 1 hr (濃度7 ug/ul)
那個sample所有的東西都做的出來
可是過了一個禮拜
我做同一個實驗 不過開始做treatment
不過因為想要放100ug total protein per lane
所以我放非常少的lysis buffer 而且改成冰上15 分鐘 4C離心十五分鐘
蛋白濃度在14 ug/ul左右
我用2x sample buffer loading dye跑gel
可是很怪的是 我load一樣的量
我第一次做的control(我拿來當western control)
似乎比我之後實驗組中的control(無treat)的高很多
也就是整個phospho-protein 強度 再我某個時期之後做的蛋白都偏低
但是我的total protein是相同的
請問是因為我clear不乾淨嗎?? 我收的時候有覺得有白白的東西在上液體
所以很多debrid都被我一起收下來了??
導致蛋白濃度根本是錯的??
還是我蛋白濃度太高了?? 所以黏在一起 可是我有用95C 10 min
or 我的phosphase inhibitor失效了??
埃 我真的不知道問題在哪裡
請各方高手替小妹指點迷津阿.....
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