Re: [求救] cloning~cloning

看板Biotech作者baca (大笨蛋大笨蛋~~~~~)時間17年前 (2007/02/15 18:06)推噓6(6推 0噓 5→)

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※ 引述《werthers6925 (...)》之銘言： : ※ 引述《baca (大笨蛋大笨蛋~~~~~)》之銘言： : : 想請問大家CLONING~~~拜託拜託~~~ : : 做好幾個月了~~還是弄不出來~~ : : 我的insert約1.8kb~~在PRIMER上設計BamHI 與 SmaI切位 : : 後來實在沒辦法就先接在TA-VECTOR上(牌子是RBC) : : 我使用的VECTOR有6.8kb : : 後來做SUBCLONE還是接不進去~~ : : GEL EXTRACTION的KIT是用慧眾的~~ : : 看圖是都有切但是就是接不進去 : : 有可能是酵素亂切嗎?!BUF壞掉嗎~~???!!!! : : 嗚嗚~~~求救~~~ : : _ : 由於你給的資訊很少, 因此就你所給我們的資訊, : 我們也很難正確的幫你判斷你真正的問題出在哪裡..... : 頂多只能告訴你該做什麼control, 該留意什麼事情.... : 如果可以的話, 不知你是否願意寫的詳細一點.... : 包括 TA-vector是用哪一家牌子?叫是什麼名稱? : vector是用哪一家牌子?叫是什麼名稱? : (這樣方便我上網找出map, 進而判斷在vector上的cut site是否選取恰當,有問題) : 最好是能把實驗流程寫一下..... : RE怎樣作用?在什麼溫度?用什麼buffer? 謝謝各位~~^____________________^我找出原因了~~ 居然是我家的BAMHI BUF壞掉~~~ 所以一直切不好~~~接不進去 : 怎樣純化DNA?用什麼方法?什麼KIT? : 您寫的越詳細, 我們才能精確的幫您判斷可能發生問題的因素..... : 言歸正傳......根據你所給的資訊....而加以推論..... : 你的insert最出是用PCR的方式做出...並且primer上加上BamHI and SamI.... : -->做不出來!! (可能是由於primer上5'端沒有額外加base所造成) : 之後, 你將insert接在TA-vector上.... : 並且先用SmaI再用BamHI切..... : -->仍然做不出來!! : (因為insert已經接在TA-vector上..就和primer上5'端有無額外加base已經無關... : 推翻先前假設.....) : 先用SmaI切, 假設你是用NEB的RE.... : SmaI是用NEB buffer4..... : 就算你沒有換buffer直接加入BamHI作用.... : BamHI在buffer4的作用活性也有75%..... : 因此RE在insert上的作用應該很好........ : 接著看vector的作用能力..... : 你說你的transformant colonies長的很多, 但很可惜沒有做vector的control.... : 由於你的colony長很多...但卻沒有一各是你要的clone.... : 因此就可以直接看成是vector的control.... : (雖然不知道挑出來的是vector only還是雜菌.....) : 也就是說.....你的vector作用不好...... : 你的問題....應該是出在RE作用在vector這各地方..... : 至於原因為何? : 由於您給的資料很少....所以無法判斷..... : 以上小弟推論.....不知有無幫上忙.... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.60.28

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Bluecold

02/15 20:43, , 1^F

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a64toto

02/15 20:49, , 2^F

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Crow22312

02/15 20:57, , 3^F

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