Re: [問題] quantitative/semi-quantitative RT-PCR
※ 引述《aggaci (有氣質的台客)》之銘言：
: ※ 引述《CErline (草螟仔弄雞公)》之銘言：
: : 這樣解釋不知道對不對……
: : PCR 要定量不是只跑膠看它的亮度，
: : 應該要一起跑一個 house keeping gene然後再去比copy number
: : 如果只是跑個膠讓 a和 b兩個 band比表現量，大概都只能算半定量……
: 不對
: semi-quantitative RT-PCR 是必須將已知濃度的template等倍數稀釋
: 分別去跑PCR，依照強弱作出一條檢量線
: 再以內差法算出未知樣品的量
: 但是說的倒簡單，PCR有saturation的問題
: semi-quantitative RT-PCR仍然沒辦法解決，所以很少人用此方法
恐怕剛好跟你說的相反喔~
絕對定量(absolute quantitation)要先用已知濃度的相同東西做出一條standard curve
(如果要測total RNA,就用已知濃度的total RNA做standard curve)
利用內插法求你的sample濃度
當然,PCR本身的一些細節條件如saturation的事情就不在這裡討論
至於半定量(semi-quantitation)則是利用一個大家都有,而且量差不多的東西
(像是house keeping gene)當作分母一樣的東西
在相同反應條件下,每一個sample都跟分母比後再做比較
你如果要問quantitative PCR,不知道是不是要問real-time quantitative PCR?
如果是的話,基本上它也分成absolute/semi quantitative
只是偵測的方式跟傳統run gel的方式不一樣,
它可以偵測到PCR的gerometric phase,這是PCR當中最符合y=2^n的時期
所以可以避開saturation的問題
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