[討論] 連猴子也懂得PCR原理(?)

看板nCoV2019作者 (反思自省很困難)時間4年前 (2020/02/18 00:24), 4年前編輯推噓39(39推 0噓 63→)
留言102則, 26人參與, 4年前最新討論串1/1
看到版上有不少人在問,想想也該發篇大家都懂通俗點的科普文章比較好 PCR簡單來說就是個複製 DNA的技術 假如DNA序列是本超厚的教科書(模板),而考試內容是考這本書的內容 你想要把要考的重點抄下來 (DNA聚合酶) 但你他媽的根本不知道要抄三小,沒人跟你說要從哪開始抄 所以需要一個導引,告訴你從哪開始 這個導引就是引子 (Primer),它告訴你從哪開始抄 知道後,你就拿著原子筆開始抄下來,而墨水就是核苷酸 (ATCG) 那一個複製DNA的技術怎麼用來檢驗呢? 假如今天你要抄寫朱自清的背影(檢驗目標,像是某種病毒) 你的引子可能是開頭 "我與父親不相見已二年餘了，我最不能忘記的是他的背影" 所以理論上你是要抄下有這段話的文章 但今天你拿到的書(檢體)是"連猴子都懂得神經解剖學" 你拿了這段引子對照了整本書,你他媽的還是不知道要抄啥 所以沒抄寫出東西(沒擴增),所以你知道這本書沒有你要的東西 大GUY4醬 不過這是複製 DNA,如果是要檢測 RNA,像是這次 SARS-Cov 2是RNA病毒 就必須要先逆轉錄 (Reverse transcription, RT) 把 RNA轉成 cDNA,你的 DNA聚合酶才懂 當然也是有能直接擴增 RNA的檢測技術像是 NASBA, TMA 不過就不說惹 有想問的我再補充 推文問到怎麼知道有沒有擴增,這邊就講一下 Real-time PCR 原理跟PCR一樣,不過多了點東西 以常用的 TaqMan probe為例,這是一種探針 探針跟引子很像,是一小段序列 (寡核苷酸),可以互補結合在 Primer之間的模板序列 不過這個探針兩端各加了兩種東西 (1) 螢光基團 (Fluorophore) (2) 淬滅基團 (Quencher) 一開始時, Quencher會藉由 FRET(一種能量轉移形式) 抑制 Fluorophore發出螢光 但當 DNA聚合酶在複製延長時 會藉由 5'-3' Exonuclease活性,把擋在路中間的探針給分解掉 當分解掉後, Fluorophore和 Quencher之間的距離拉大分開了 此時就能順利激發出螢光,並能被偵測到 就能知道有擴增出東西來 https://imgur.com/nsZQxHH
(https://en.wikipedia.org/wiki/TaqMan) ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 61.230.160.66 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/nCoV2019/M.1581956654.A.73B.html
推
02/18 00:28, 4年前 , 1F
想請問是怎麼判斷有沒有擴增的呢？謝謝
02/18 00:28, 1F
推
02/18 00:30, 4年前 , 2F
跑電泳
02/18 00:30, 2F
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02/18 00:32, 4年前 , 3F
話說我google之後看不懂real time的差別
02/18 00:32, 3F
※ 編輯: Reflection11 (61.230.160.66 臺灣), 02/18/2020 00:55:04
推
02/18 00:34, 4年前 , 4F
怎麼判斷擴增呢？電泳可，real time
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PCR可以邊做邊看有沒有擴增
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02/18 00:35, 4年前 , 6F
real time RT-PCR就是目前的做法
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real time Reverse Transcription P
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PCR
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推
02/18 00:36, 4年前 , 9F
感謝!!
02/18 00:36, 9F
推
02/18 00:38, 4年前 , 10F
real time就是你在做反應的時候就可以知
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02/18 00:38, 4年前 , 11F
道他有沒有在擴增了 所以叫即時的 一般p
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02/18 00:38, 4年前 , 12F
cr你要反應完跑電泳才知道
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02/18 00:39, 4年前 , 13F
原來差在這裡，這樣講我就懂了
02/18 00:39, 13F
推
02/18 00:40, 4年前 , 14F
real time 就是有一個螢光的dye 當它bind
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到雙股DNA時訊號會放大。這樣的話你就可
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以"real time” monitor PCR的過程。
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推
02/18 00:41, 4年前 , 17F
樓上晶晶體(X XDD
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推
02/18 00:42, 4年前 , 18F
生物出國才開始學很多中文不知道怎麼說
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02/18 00:42, 4年前 , 19F
sorry 囧
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02/18 00:44, 4年前 , 20F
正常啦 跟教授討論也是中文+英文
02/18 00:44, 20F
推
02/18 00:48, 4年前 , 21F
生科不可避免的晶晶體
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推
02/18 00:49, 4年前 , 22F
real time 簡單說就是在複製DNA的
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時候，成功複製出來的DNA會有螢光
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，所以如果檢體有病毒的核酸，隨著
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複製的循環越來越多次，反應液就會
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越來越亮。機器可以偵測亮度的變化
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，另外，如果循環個幾次就偵測到訊
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號，那就可以間接推論原本的病毒濃
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02/18 00:50, 4年前 , 29F
度比較高；反之循環到快三十次才偵
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測到亮光，那就是病毒含量比較低
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02/18 00:50, 4年前 , 31F
以上
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推
02/18 00:50, 4年前 , 32F
感謝樓上與每位回覆的專家
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02/18 00:51, 4年前 , 33F
其實我google很久但沒基礎實在看不懂...
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02/18 00:51, 4年前 , 34F
希望有幫助XD
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02/18 00:51, 4年前 , 35F
有問題可以再問
02/18 00:51, 35F
推
02/18 00:54, 4年前 , 36F
02/18 00:54, 36F
推
02/18 00:54, 4年前 , 37F
CDC 是重複 45 cycle 檢測方法有公布
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02/18 00:54, 4年前 , 38F
這個表就是所謂的引子(Primer)嗎？
02/18 00:54, 38F
還有 25 則推文
還有 3 段內文
推
02/18 01:38, 4年前 , 64F
要用抗體抓 抗體專一性很重要 不好的
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02/18 01:38, 4年前 , 65F
可能抓出一堆雜 band 那也有得搞了 各
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02/18 01:38, 4年前 , 66F
有優缺啦
02/18 01:38, 66F
推
02/18 02:03, 4年前 , 67F
現在的問題是連美國CDC都還沒來得及去驗
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02/18 02:03, 4年前 , 68F
證這個方法的準確性。
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推
02/18 02:06, 4年前 , 69F
02/18 02:06, 69F
推
02/18 02:47, 4年前 , 70F
你這篇害我回到大學的痛苦時光
02/18 02:47, 70F
推
02/18 02:59, 4年前 , 71F
ㄎㄎ的日常
02/18 02:59, 71F
推
02/18 03:04, 4年前 , 72F
推比喻淺顯易懂XD
02/18 03:04, 72F
推
02/18 03:26, 4年前 , 73F
生科推
02/18 03:26, 73F
推
02/18 03:42, 4年前 , 74F
對不起我們都只用sybrGreen
02/18 03:42, 74F
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02/18 03:43, 4年前 , 75F
Taqman法實在太高大尚~
02/18 03:43, 75F
推
02/18 04:20, 4年前 , 76F
PCR之歌經典 XD
02/18 04:20, 76F
推
02/18 04:20, 4年前 , 77F
幫推
02/18 04:20, 77F
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02/18 05:01, 4年前 , 78F
上面說抗體抓出雜band，PCR也有一樣的問
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02/18 05:02, 4年前 , 79F
題，而且就算primer設計在專一序列，
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02/18 05:03, 4年前 , 80F
anealing溫度沒設定好一樣會有偽陽性
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而且PCR的偽陽性應該比免疫偵測高，畢竟
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02/18 05:03, 4年前 , 82F
是放大再放大，做錯了一樣放大
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02/18 05:04, 4年前 , 83F
不過偽陽性是可以接受的，比起錯放，寧
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可有偽陽性
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02/18 05:05, 4年前 , 85F
免疫偵測法的問題主要不在專一性，而是
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02/18 05:06, 4年前 , 86F
它的偵測極限終究比不上PCR
02/18 05:06, 86F
推
02/18 05:41, 4年前 , 87F
蛋白質專一性結合的問題很大呀，有做過We
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02/18 05:41, 4年前 , 88F
stern blotting就知道了
02/18 05:41, 88F
推
02/18 05:44, 4年前 , 89F
PCR的準確率比較高，尤其病原體的基因和
02/18 05:44, 89F
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02/18 05:44, 4年前 , 90F
人的差異這麼大，primer的設計簡單又快速
02/18 05:44, 90F
推
02/18 07:31, 4年前 , 91F
講得不錯 推
02/18 07:31, 91F
推
02/18 07:38, 4年前 , 92F
先推
02/18 07:38, 92F
推
02/18 07:41, 4年前 , 93F
講的比老師說的還要聽得懂..推推
02/18 07:41, 93F
推
02/18 08:57, 4年前 , 94F
推
02/18 08:57, 94F
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02/18 09:34, 4年前 , 95F
rtpcrq的偽陽性比較低啦 因為還要taqmam
02/18 09:34, 95F
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02/18 09:34, 4年前 , 96F
probe接的上去
02/18 09:34, 96F
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02/18 09:35, 4年前 , 97F
要更保險就產物拿去定序
02/18 09:35, 97F
推
02/18 09:39, 4年前 , 98F
Western blot 會很髒 麻煩
02/18 09:39, 98F
※ Reflection11:轉錄至看板 Gossiping 02/18 17:36
推
02/18 20:08, 4年前 , 99F
我好懷念PCR之歌XDDD
02/18 20:08, 99F
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02/18 20:10, 4年前 , 100F
qPCR準確性我覺得真的比ELISA高，且需要
02/18 20:10, 100F
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02/18 20:10, 4年前 , 101F
的時間基本上也比較少，只要有好的primer
02/18 20:10, 101F
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02/18 20:10, 4年前 , 102F
+probe就很好用
02/18 20:10, 102F
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