細菌質體少量製備
少量質體DNA之製備
--------------------------------------------------------------------------------
I.目的
自大腸桿菌菌株中分離純化pINDLacZ (pINDLacZ上帶有b-gal DNA片段)及pT7-6 (其上具有prokaryotic phage T7 promoter)。學習利用Alkaline（NaOH及SDS)、boiling (lysozyme) 及column tip等數種方法，使菌體分解或破碎，以釋出質體DNA，（再以phenol/chloroform [注意：會腐蝕皮膚，小心操作]萃取，以去除雜質），最後以酒精和鹽類將DNA沈澱。
II.概述
質體DNA是一種獨立於染色體DNA之外的環狀DNA小分子，通常只有數千個鹼基對（kb），它具有自行複製的能力。在生物技術的應用上，質體DNA常被用以選殖特定的DNA，以及表現特定的蛋白質之用。目前應用於質體DNA的純化或抽取的方法眾多，例如鹼溶裂法（alkaline lysis）、沸騰法（boiling
method）、氯化銫（CsCl）純化法，及市售之管柱層析套組等。最常用的鹼溶裂法效率高、價廉、簡單易學為其優點，對分子生物初學者而言，此法為必學的基礎技術。其原理乃利用鹼性處理質體DNA及染色體DNA，使兩者雙股打開呈單股狀態，再加入酸中和，使單股回復為雙股DNA，同時在急速中和反應中，染色體DNA因分子過於龐大以致於鹼基匆忙配對，形成一雜亂無序的巨大分子，對水的相對溶解度低而易被沈澱下來。相反的，質體DNA因分子小，兩單股DNA恢復原鹼基配對快而易溶於水中，故只要經過離心，即可將染色體DNA與質體DNA分離。在實驗步驟中，加入Solution
I的目的主要是將細菌團塊重新懸浮於緩衝溶液中，Solution II含有SDS及NaOH，前者可將細菌溶解，後者可將DNA變性，Solution III是由醋酸及鉀鹽所形成，前者在於中和鹼性，後者則與DNA形成錯合物而有利於DNA的沈澱。待加入Solution III後離心，大部分的蛋白質與染色體DNA會留在下面的有機層，而上面的水層所含的質體DNA可用酒精沈澱之，（亦有實驗室用酚/氯仿/異戊醇[PCI]萃取以去除殘留的蛋白質），再以70％酒精洗滌以去除鹽類。
小量製備 (mini-prep) 是從轉形過的大腸桿菌寄主中分離質體DNA之快速方法，比用CsCl密度梯度超高速離心的標準大量製備 (large-prep) 簡單多了。小量製備出的DNA可應用於分子選殖 (molecular cloning) 實驗，例如進行限制?切割及電泳分析等。除了alkaline及boiling methods，重組DNA技術日益進步，新的方法層出不窮，現已有分子生物廠商發展利用管柱層析法 (column chromatography)
進行小量質體DNA的製備，更較傳統方法省時，但價格較為昂貴。本實驗所使用的pINDLacZ及pT7-6均含有b-lactamase基因，會產生peripasmic酵素，把盤尼西林衍生物ampicillin (Amp)切開，ampicillin主要的作用機制在於抑制細菌細胞壁的合成。
III.Alkaline method (鹼性溶裂法)
1.本實驗是以alkaline lysis的方法進行，其原理是將大腸桿菌以NaOH及SDS分解，並使蛋白質及DNA變性，繼之以酸中和。在此情況下，小分子質體DNA在中和後可恢復原狀，但大部分的大腸桿菌染色體DNA則無法完全復原而與SDSD-K+所含之複合物一起沈澱下來，可以離心去除之，上清液所含之質體則可以酒精(ethanol)或異丙醇(isopropanol)將其沈澱下來。
2.儀器用具:
a. 無菌操作台(laminar flow)
b. 桌上型離心機(microcentrifuge)
c. 微量吸管(pipetman)
d. 真空乾燥機(speed vac)
3.材料:
於實驗前一天，將大腸桿菌DH5a分別含質體pINDLacZ及pT7-6接種至3 ml含ampicillin (50 mg/ml)的LB培養液中，並在37 oC下振盪培養過夜。
4.藥品及試劑:
a. Solution I: 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM glucose
b. Solution II: 0.2 N NaOH, 1% SDS (使用前以10 N NaOH與10% SDS稀釋配製)
c. Solution III: 3 M醋酸鉀溶液(KOAc, pH 5.2)
d. RNase A: 1 mg/ml (100 ℃ 加熱30分鐘去除DNase活性)
e. TE buffer: 10 mM Tris-HCl (pH8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0)
f. 100% 酒精(ethanol)或異丙醇(isopropanol)
g. LB(Luria-Bertani)培養液: 10 g tryptone, 5 g yeaste extract, 10 g NaCl in 1 L
5.方法步驟:
1) 將過夜菌液分別倒入1.5 ml微量離心管中以6,000 rpm離心2分鐘後，倒去上清液(兩種質體均請製備兩管)。
2) 沉澱菌體加入50 ml Solution I，劇烈振盪使菌體完全懸浮，置於室溫5分鐘。
3) 加入100 ml Solution II，蓋上管蓋後將管子反覆上下搖動3次，不可振盪(Do not vortex!)，置於室溫5分鐘。
4) 加入75 ml Solution III，亦溫和搖勻，置於室溫5分鐘。
5) 以12,000 rpm 離心5分鐘，小心吸取上清液至另一微量離心管中。
6) 加入2倍體積100% 酒精(或0.6倍體積之異丙醇)，混合均勻，置於室溫2分鐘。
7) 以12,000 rpm 離心10分鐘，倒掉上清液，加入70% 酒精清洗一次，置於真空乾燥機中10分鐘(欲去除RNA，可加入RNase A使其最終濃度為10~20 ml/ml，再做PCI萃取及酒精沈澱)。
8) 加入50 ml TE buffer或水，以懸浮DNA。
IV.Boiling method (快速沸騰法)
1.儀器用具:
同alkaline method另需水浴槽(water bath)或乾浴器(dry bath incubator)
2.材料:
同前
3.藥品及試劑:
a. lysozyme: 10 mg/ml in 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)
b. NH4OAc: 7.5 M NH4OAc
c. STET buffer: 取等體積之16% glucose與1% Trixton X-100, 100 mM EDTA, pH 8.0, 20 mM Tris-HCl, p H 8.0相混合
d. 100% ethanol or isopropanol
4.方法步驟:
1) 將過夜菌液分別倒入1.5 ml微量離心管中以6,000 rpm離心2分鐘後，倒去上清液(兩種質體均請製備兩管)。
2) 加入350 ml STET，劇烈振盪，使菌體完全懸浮，再加入25 ml lysozyme混合均勻，置於室溫五分鐘，用parafilm將管子封住。
3) 放入沸水中煮40秒(注意:小心燙傷!)，以12,000 rpm離心10分鐘，利用yellow tip將白色的細胞碎片挑剔除去。
4) 加入0.5倍體積之7.5 M NH4OAc及2倍體積之酒精，混合均勻，置於-20 oC 15分鐘以沉澱DNA。
5) 12,000 rpm 離心10分鐘，倒掉上清液，加入70%酒精清洗一次，置於真空乾燥機10分鐘。
6) 加入50 ml TE buffer或水，再次懸浮DNA。
V.Column tip method
1. 各家廠牌的質體DNA mini-prep kit有不同的方法，不過大體上是大同小異，請依照kit提供的要點指示進行，以下僅以Qiagen tip為例。
2. 材料:
同前
3. 藥品及試劑:
由kit提供
4. 方法步驟:
1) 將過夜菌液分別倒入1.5 ml微量離心管中，以6,000 rpm離心2分鐘後，倒去上清液，再加入1.5 ml菌液，同法離心。
2) 加入300 ml P1 buffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0及RNase A 100 ml/ml)，劇烈振盪使菌體完全懸浮。
3) 加入300 ml P2 buffer (0.2 N NaOH, 1% SDS)，蓋上管蓋後將管子溫和搖勻，置於室溫五分鐘。
4) 加入300 ml P3 buffer (2.55 M KOAc, pH 4.8)，亦溫和搖勻，置於室溫5分鐘。
5) 12,000 rpm離心10分鐘，在此離心之際，準備架好Qiagen-tip 20，加入1 ml QBT buffer (0.75 M NaCl, 50 mM MOPS, 15% ethanol, pH 7.0)於tip中，利用地心引力洗滌。
6) 待QBT buffer流完後，將離心後的上清液加到tip中。
7) 待上清液流完後，加入1 ml QC buffer (1 M NaCl, 50 mM MOPS, 15% ethanol, pH 7.0)，洗滌共四次。
8) 加入800 ml QF buffer (1.2 M NaCl, 50 mM MOPS, 15% ethanol, pH 8.0)，tip下用1.5 ml離心管來接DNA流出。
9) 加入560 ml異丙醇，以12,000 rpm離心10分鐘，倒掉上清液，加入70%的酒精清洗一次，置於真空乾燥機10分鐘。
10)加入50 ml TE buffer或水，再次懸浮。
--
搖一柄桂槳，邀你溫情河裡泛舟
你可願意？
河是深了點，但那是思念溪彙成的河流
真愛沉不了
何況還有我深情的雙眸相擁你左右
你還在忐忑？
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.csie.ntu.edu.tw)
◆ From: 140.112.240.2
推
推 140.112.59.205 01/10, , 1F
推 140.112.59.205 01/10, 1F