[心得] 威士忌發酵時如何產生酯類
威士忌中存在有許多化合物，其中酯類是非常重要的一類化合物，
它可以帶來多種果香與甜香，但它是怎麼生成在威士忌中的呢？
一般來說，威士忌在桶中熟成階段時新酒中的醇類會被氧化成醛類而後再氧化為酸類，
氧化後形成的酸類與新酒中原本的酸類會與醇類反應而形成酯類。
這種自然形成的酯化反應是簡單的化學作用，但所需的時間非常久，
且如果是在玻璃瓶中陳年而非木桶陳年的話，幾年後酯類含量甚至可能會不升反降。
再往回推到蒸餾的步驟。
蒸餾前的發酵液(酒汁)中其實已經有不少酯類了，而蒸餾後酯類會下降，
如果不使用銅製蒸餾器的話蒸餾後酯類的下降比率幾乎都會更高
(這裡就可以看出銅在蒸餾時的重要性)，所以酯類也不算是蒸餾產生的。
酯類含量在發酵前的麥汁中算是微乎其微，但經過短短幾天的發酵後卻增加了非常多，
所以發酵算是一個酯類產生的重要起源，那發酵時酯類是如何產生的呢？
前面說道，光靠酸與醇自然脫水合成酯類的酯化反應是非常慢的，
而發酵只有短短幾天而已，所以此時產生的大量酯類沒理由是只靠酯化反應就能達成的。
事實上，發酵時酯類的形成主要是藉由酵母體內的許多酵素(酶)所合力快速生成的。
為什麼發酵時酵母要產生酯類呢？這個答案目前還不是很清楚，
有種推測是為了消除酵母體內脂肪酸所帶來的毒性。
酵母為了使細胞膜更具完整性並使之能分裂繁殖後代，會製造許多長鏈不飽和脂肪酸，
這些長鏈不飽和脂肪酸是由短鏈飽和脂肪酸慢慢加長碳鏈再靠氧氣使其不飽和化生成的。
發酵很早期麥汁中還有氧氣時，製造不飽和脂肪酸時沒什麼問題，
但初期氧氣很快就會被用光，而之前合成的一些脂肪酸就變成了頭疼的問題，
因為這些酸類對酵母會造成毒性(特別是中鏈脂肪酸)，所以酵母想盡快把他們排出體外。
不過這些酸類因結構的關係較難直接排出體外，
如果把他們轉化為酯類就比較容易擴散出體外了，
這的確可能是酵母生成酯類的原因之一，而其他的原因現在仍有待研究中。
酒汁中酯類有許多種，不過限於篇幅原因(其實單純是因為懶惰)，
所以這裡只介紹酯類中最多的乙酸乙酯主要是如何在威士忌發酵時形成的。
酵母要合成乙酸乙酯時必須要有兩個重要的原料，一個是乙醇，另一個是乙醯輔酶A。
首先先看這張圖：https://imgur.com/a/GVPZDse
剛提到的原料之一是圖中左下角的乙醯輔酶A，
這是個很重要的物質，由乙醯基與輔酶A(也就是圖中的CoA)所構成，
無論是細胞膜重要材料(固醇與長鏈不飽和脂肪酸)的合成，
或是檸檬酸循環的初始步驟都會用到它。
左上角的丙酮酸是葡萄糖分解所產生的中間物質，
發酵時一個葡萄糖可以產生兩個丙酮酸，這兩個丙酮酸最後會變成兩個乙醇。
酵母威士忌發酵時即使有氧也難以進行完整的呼吸作用，
因為呼吸作用的第一步是先從丙酮酸走(A)路線變為乙醯輔酶A，
而啤酒酵母因為發酵初始有氧時受到葡萄糖抑制的關係，
所以基本上無法走(A)路線來生成重要的乙醯輔酶A，
而是必須靠(B)→(C)→(D)的替代路線來生成乙醯輔酶A。
而發酵進入到無氧時酵母也因(A)路線的丙酮酸脫氫酶需要氧氣才能運作，
只能被逼著同樣走(B)→(C)→(D)的替代路線來生成乙醯輔酶A。
至於乙醇則是糖發酵時會一直被產出的最終產物之一，所以來源非常穩定。
有了這乙醇與乙醯輔酶A這兩樣材料後，
酵母會藉由一種稱為醇醯基轉移酶(Alcohol acyl transferase)的酵素，
來幫忙快速將這兩樣東西結合，形成乙酸乙酯與輔酶A，
這個生化作用的速度比簡單的酯化反應快了上萬倍至數百萬倍呢！
從這邊推演下去，
如果是其他醯基輔酶A(例如丁醯輔酶A)跟乙醇結合，就會變X酸乙酯(例如丁酸乙酯)，
而乙醯輔酶A若與其他高級醇結合(如異戊醇)則會形成乙酸X酯(如乙酸異戊酯)，
當然Y醯輔酶A與Z醇就是變成Y酸Z酯啦。
至於那些Y醯輔酶A與Z酯的形成途徑那又是另外兩個故事了...。
說到這看起來很複雜，但最主要想要表達的只有一件事情，
就是威士忌發酵的時候產生酯類並不是單純靠的酯化反應，
而是靠酵母體內的酵素進行生化反應所形成的，
以後別再聽到酯類就只想到酸與醇進行的酯化反應囉。
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葡萄糖抑制又稱碳分解代謝去活與抑制(Carbon catabloite inactivation and repress-
ion)，是一種高糖度時許多基因的轉錄會受到抑制的現象(碳分解代謝抑制)，與觀察到S.
cerevisiae在有葡萄糖的情況下成長時有許多蛋白質與轉運系統會迅速被活化或去活的現
象(碳分解代謝去活)。這種情況無論是在有氧或無氧時都會發生，至於發生原因目前我還
沒找到確切的論文證據。
初期麥汁中的葡萄糖含量仍很高，這時葡萄糖會對丙酮酸脫氫酶複合物的其中一個重要的
組成元件-硫辛醯胺脫氫酶(lipoamide dehydrogenase)造成葡萄糖抑制，使丙酮酸脫氫酶
難以完整運行，因此丙酮酸較難藉由該路徑產生乙醯輔酶A。這最終造成的結果雖然跟
Crabtree effect的結果很像，但原理上是有些不同的。附帶一提，硫辛醯胺脫氫酶也是
酮戊二酸脫氫酶複合物的組成部分，這也是S. cerevisiae厭氧生長時無法完整進行TCA循
環的原因之一。
※ 編輯: lovemoonman (36.234.120.249 臺灣), 09/05/2021 08:43:12
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以理論上來說是因為酯類的形成在後期會比前期快，但麥汁中的糖都利用完後速度應該就
會下降了(較無充足能量來滿足乙醯輔酶A的供應，只能使用儲備的糖原)，但我手上沒有
充分的資料來確認是否任何情況下常發酵所產生的酯類總量都會比較多。
長發酵可對威士忌賦予更多的果味和酯味，是個目前仍在研究中重要的課題，但已有一些
實驗結果。一般威士忌發酵約40小時酵母就把糖吃光了，後期酵母會進入飢餓狀態並逐漸
死亡，此時發酵會改由乳酸菌與其他雜菌主導。
時間拉長造成的影響我資料比較不足，但有找過一篇發酵時間對殘糖造成的影響，這篇可
以在網路上找到，我抽出裡面的一些資料供大家參考：https://imgur.com/a/xI2v4iZ
我手上還有些些後期乳酸菌造成影響的資料。這張圖是發酵時酒中的主要菌種依時間的分
佈：https://imgur.com/a/UhMylZb
圖中可知酵母菌與野生酵母會在後期出現，事實上後期常還會伴隨其他雜菌。這些雜菌會
代謝出其他風味物質影響香氣，較明顯的是此階段會發生乳酸累積與乳酸乙酯濃度上升，
下圖是將麥汁先加酵母以不同溫度發酵24小時候，再將部分樣本加入乳酸菌保持溫度發酵
至168小時，最後以相同方式蒸餾取得新酒，並對新酒做的一些化學分析。其中"+菌"是有
加乳酸菌的樣本，總發酵時間跟沒加乳酸菌的樣本一樣久(168小時)，"無菌"的則是發酵
前對麥汁先完全殺菌才接種酵母且之後不添加乳酸菌的樣本。
實驗結果：https://imgur.com/a/efJoWqx (右上圖標應該沒包含乙酸乙酯)
從上面幾份資料發現乳酸乙酯的含量變化較為明顯，但乳酸乙酯與一些個別的酯類對果香
和酯香的影響程度目前尚無定論，較有可能的是他們蒸餾後與其他酯類共同造成的香氣交
互影響才使最終風味造成變化。
另外長發酵時還會產生一些香氣閾值較低的酯類，也會對香氣造成影響。以內酯(lactone)
類來說，γ-癸內酯跟γ-十二內酯會有甜味與奶油香，這些則是酵母從頭合成(de novo)或
利用羥基脂肪酸合成的。上述提到發酵後期乳酸菌開始發展起來，並分泌羥基脂肪酸(特別
是10-羥基棕櫚酸與10-羥基硬脂酸)來對抗酵母菌，酵母的對抗方式則是將10-羥基棕櫚酸
氧化成γ-癸內酯、將10-羥基硬脂酸氧化成γ-十二內酯，所以算是兩菌戰爭時的產物。
至於長發酵時出現的其他雜菌可能造成的影響，建議參考2014年的Whisky: Technology,
Production and Marketing.一書第8章，在此就不詳述了。
※ 編輯: lovemoonman (36.234.120.249 臺灣), 09/06/2021 22:55:55
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