[公告] 生物實驗 小量質體DNA製備 講義更新
小量質體DNA製備
目的：利用細菌的生理特性及藥物之處理，將E. coli 的菌體分解或打破，以分離及純化
出質體(plasmid) DNA。
原理：
此實驗為利用小量質體純化試劑組來抽取大腸桿菌質體DNA 之快速方法，以改良過的
鹼溶裂法打破細胞，並配合所選的吸附膜純化管組，從細菌中萃取質體DNA。
利用含SDS的鹼性溶液處理細胞。SDS可將細胞膜打破，而鹼會破壞DNA的氫鍵，導致
DNA變性(由雙股變為單股狀態)，再加入酸性溶液中和後，使單股回復為雙股DNA。在急速
中和反應中，染色體DNA因分子龐大鹼基匆忙配對形成一雜亂無序的巨大分子，對水的相
對溶解度低。相反的，質體DNA因分子小，兩單股恢復鹼基配對快而易溶於水中 ，故只要
經過離心，即可將染色體DNA與質體DNA分離。
再利用silica membrane的column來萃取上清液。因核酸在高鹽下質體DNA能與
silica membrane吸附在一起，而蛋白質、多醣類或脂質則無法吸附。利用含有酒精的
Wash buffer清洗silica，將殘留蛋白質、多醣類或脂質清洗。最後以低鹽溶液(水或TE
buffer)將核酸從silica 上清洗下來。
實驗器材：
含有質體的大腸桿菌E.coli (pCDH)
High-Speed plasmid mini kit
離心管
離心機
電泳裝置
實驗步驟：
1. 將培養好的菌液取1 .5ml於離心管中，以14000xg離心1分鐘，使液態培養基中的菌體
集中於管底，離心完後去除上清液。
2. 加入200μl的PD1 Buffer，以震盪器將沉澱的菌體打散至均勻混合。
3. 加入200μl的PD2 Buffer ，輕輕的上下反轉tube(約10次左右)，置於室溫3分鐘。
4. 加入300μl的PD3 Buffer ，輕輕的上下反轉tube(約10次左右)，以14000xg離心3分鐘
。
5. 將column插入collection tube中，將步驟4離心後的上清液倒入column，再以
14000xg離心1分鐘。
6. 將濾液移除後，再把column插回collection tube後加入400μL W1 Buffer於column
，之後以14000xg離心1分鐘。
7. 將濾液移除後，再把column插回collection tube後加入600μL Wash Buffer並以
14000xg離心1分鐘。
8. 將濾液再次除去後，再把column插回collection tube後以14000xg離心3分鐘。
9. 移除collection tube將column置於另一個新的離心管中，之後加入50μL的Elution
Buffer至column中靜置2分鐘後，以14000xg離心2分鐘。
10. 取DNA溶液跑電泳。
問題與討論：
1.請說明此實驗分離plasmid的方法如何將chromosomal DNA去除而保留plasmid DNA？
2.為何solution II加入後僅能將管子上下反轉而不可劇烈震盪呢?
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結報別寫錯囉~
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