[課程] 分生實驗補充

看板NDHU-LS101作者zeroking0519 (麵包)時間14年前 (2010/04/12 22:55)推噓8(8推 0噓 5→)

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因為...很多人來問我上禮拜實驗的事... 所以...我決定...當一次好人.... =================================正文開始===================================== 你們的分生課似乎正好在上到transcription，那...http://ppt.cc/P6~C 這是一些關於transcription的影片，可以自己去看看還有.http://ppt.cc/FOHG 這是Wiki說的transcription，還不錯詳細 (英文) 然後.http://ppt.cc/AWRG 這是Wiki官於RNA polymerase的介紹 (英文) 其中.http://ppt.cc/akqp 也有介紹T7 RNA polymerase的東西 (英文) 之中.http://ppt.cc/oGNX 還有promoter這種東西也很重要 (英文) So~自己去看，加油啦，閃人~~~~ ==============================好了，就這樣囉================================== 想走! 快給我回來 ( ‵□′)───C＜─___-)||| 你不把事情交代清楚是不會讓你走的 <( ￣ㄧ￣)q▄︻═╤═─ \(￣□￣")/ )˙ ˙( (˙人˙ ) 是是是...我做，我做 ///Orz... ／凸＼ / \ ============================================================================== 基本上張媽上課一定會講到 [Central Dogma]，基本上就是訊息在分子間的傳遞，在 http://biotech.nstm.gov.tw/03/032.asp 就說的很詳細不再贅述。以DNA為模板做出RNA，這個步驟就叫做transcription。而細胞中有數以萬計的基因因為不同的調控都在進行transcription，這些以不同基因為模板做出來的RNA主要分為四大類 I. mRNA <=== 會再更近一步進行translation。 II. tRNA III. rRNA IV. siRNA 這四種RNA分別在細胞中扮演不同的角色。而在真核生物的細胞中，mRNA還會進行轉錄後修飾(post transcriptional modification) 包含5'端 capping、3'端加上polyA tail，還有RNA的splicing。若是我們把細胞中的total RNA萃取出來，RNA的成份就會很複雜。包括了正在表現的mRNA和siRNA，還有恆常表現的tRNA和rRNA。那total RNA究竟有什麼作用呢? 既然可以抽取到細胞目前所在表現的RNA，科學家就可以利用這種方式去研究細胞在不同狀態下有哪些RNA的表現，例如:正常細胞和癌細胞RNA表現的差異；成人和幼兒RNA表現差異；吸收藥物的細胞和沒給藥物的細胞RNA表現的差異， .....................等等不同的實驗，你想到有差異的都可以試試看。但是這種情況有一種缺點，如果今天小明想要單獨研究一段RNA的功能，要叫他從total RNA中純化出單一他感興趣的RNA是完全不可能的。所以小明就想到一個方法， ┌─────────────────┐ │先把那段基因clone到一個plasmid上，│ │ │ │把plasmid送到細菌裡面大量表現， │ │ │ │把plasmid純化出來， │ │ │ │加入RNA polymera做出需要的RNA!! │ └─────────────────┘ 真是太完美了~~~來設計實驗吧! 恩..clone好簡單~我會， transformation連大學生都會做阿抽plasmid...太EASY了恩...transcription...transcription...沒做過ㄝ =口= 快來去查資料究竟transcription需要些什麼呢?? DNA ===> 有了 (就是前面準備的plasmid阿) transcription最終的產物是RNA，所以需要RNA的單體，也就是 ATP、UTP、CTP、GTP (<===為了稱呼上的方便，在這裡都全部統稱rNTP) 需要有RNA polymerase幫忙做出RNA。那什麼RNA polymerase最方便阿??那選個噬菌體的RNA polymerase好了 (因為噬菌體是很簡單，已經被研究透徹了，EX:T3、T7、SP6) 好啦~~~都有囉，全部加再一起攪一攪。奇怪...RNA還是沒有出現ㄝ，問題出在哪? 原來做transcription的時候RNA polymerase需要辨認DNA上的promoter阿 (promoter這觀念有一點點難懂，基本上它是一段DNA sequence， ) (上面的特殊序列剛好可以讓RNA polymerase做binding，並啟動之後的transcription) 那就在plasmid上面多加入promoter，再把要表現的RNA接在promoter後面無敵啦~~~一定成功!! 疑??這次雖然有做出RNA，但是RNA的屁股(3'端)卻多出了一些額外的RNA耶這是怎麼一回事呢? 原來~~RNA在細胞裡面表現的時候，除了辨認promoter外，做到最後還會辨認terminator 不然一條DNA這麼長是要做到哪裡去阿 (汗) 可是還要在plasmid上面加入terminator會不會太麻煩了點......好討厭，想想別的辦法有了!! 只要在我想要表現的蛋白質最後面設計一個限制酶切位把DNA切斷 RNA polymerase做到最後就掉下來啦!! RNA也只做到屁屁，不會再多一些有的沒的啦 ~~\(^▽^)/~~ 可是...RNA做完...裡面還有模板(DNA)和RNA polymerase耶沒關係，加入DNase把DNA分解，再用pheno/chroloroform/IAA分離出RNA，最後用酒精把鹽類洗掉~~~ (最後的三個步驟花太多時間，就沒有給你們做了) 可喜可賀可喜可賀，小明終於可以研究他的RNA了。 ※後記:小明真的是這世界上最衰，最聰明，也最蠢的人了。 ============================================================================== 夭壽...打一個半小時，不知道這種呈現方式會不會讓你們比較暸解實驗在做什麼，包括簡單的原理和目的。有不懂得話...我最前面PO的連結稍微看一下也可能會暸解多一點，真的完全不懂的話就來實驗室吧。有什麼問題或是想要討論的也可以直接推文討論唄 PS:究竟會不會有人被最前面的大空白婊到，然後髒話連連 XD PS:這花了我ㄧ個半小時... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 114.44.202.82

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zeroking0519

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zeroking0519

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推

peterdffr

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