[實驗] HPLC 定量與peaK問題(初學者)

看板Chemistry作者 (handsome)時間6年前 (2018/02/02 22:54), 6年前編輯推噓8(8推 0噓 17→)
留言25則, 7人參與, 6年前最新討論串1/1
機型:Hitachi 5110 管住:NH2P-50 4E size: 4.6 (ID), 250(Length) particle size(um) : 5 移動相:75% 乙腈 流速: 1 ml/min 偵測器: RI dector, 5450 refraction index detector(Hitachi) 因為前人的數據有問題，老闆希望解決，所以小弟要打HPLC，修正此問題，但小弟從未碰 過，所以想請教各位大神一些問題， 其問題是樣品經過酵素反應後，經過稀釋並加入乙腈調整至75%，打HPLC偵測剩下多少糖 類和合成多少，結果Total的量超過原本反應前的含量，老闆推測是lactose和sucrose定 量有問題，因為樣品中的lactose(9分鐘)和sucrose(8分鐘)之peak無法分開(如圖: https://imgur.com/a/Z0vZr，但參考各文獻除機型外，其餘條件相同，lactose和 sucrose之peak卻可以完全分開，不知是因為機型問題還是其他原因? 若lactose和sucrose之peak無法分開，定量面積(面積是系統自己計算)會受到影響嗎? 那是否可以用lactose和sucrose混合後打HPLC製成一條標準曲線，再去定量前人結果嗎? 若要將兩者peak分開，除調整移動相濃度外，溫度和流速會有影響嗎? 最後的問題是，若更改條件將lactose和sucrose之peak分開，以此條件，將lactose和 sucrose混打製成標準曲線，再用原本條件將lactose和sucrose混合後(peak未分開)製成 標準曲線，兩者曲線比較找出換算的係數，把前人的數據帶入後修正結果，此法是否能修 正前人定量的問題 麻煩各位大神可解答小弟疑惑，感恩不盡 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.120.104.80 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Chemistry/M.1517583254.A.CCB.html ※ 編輯: bill00202000 (140.120.104.80), 02/02/2018 22:56:46
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02/03 09:18, 6年前 , 1F
Column效能是否有降低？
02/03 09:18, 1F
column是新的，效能應該不會這麼快降低 ※ 編輯: bill00202000 (110.28.73.101), 02/03/2018 14:36:25
推
02/03 18:51, 6年前 , 2F
儘管都是c18的管柱 也會因為特性不同 而有不同rt 能吧
02/03 18:51, 2F
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02/03 18:51, 6年前 , 3F
peak分開的方法有很多 最重要你要先要概念
02/03 18:51, 3F
推
02/03 18:53, 6年前 , 4F
文獻給的參數不是通用的 多少會有些微差異 而不同條
02/03 18:53, 4F
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02/03 18:53, 6年前 , 5F
件的數據也不能混合使用 哪有這麼省事的啊
02/03 18:53, 5F
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02/03 18:54, 6年前 , 6F
你那樣算造假了 因為不是用新條件跑出來的
02/03 18:54, 6F
推
02/03 19:42, 6年前 , 7F
溫度 管柱長度 移動相比例 流速都會影響 你要先有概
02/03 19:42, 7F
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02/03 19:42, 6年前 , 8F
念 才知道要動哪個參數 但就算try出新條件 你終究要
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02/03 19:42, 6年前 , 9F
重做前人的樣品重新分析 沒有什麼可以換算的 論文造
02/03 19:42, 9F
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02/03 19:42, 6年前 , 10F
假沒聽過嗎？
02/03 19:42, 10F
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02/05 12:51, 6年前 , 11F
請寫出管柱規格
02/05 12:51, 11F
感謝樓上的回答，換算這件事我知道不可以，但此方式不是我能說不要，頭上的人吩咐， 雖然有反應過，呵呵～ 管注規格: NH2P-50 4E size: 4.6 (ID), 250(Length) particle size(um) : 5 ※ 編輯: bill00202000 (39.12.100.42), 02/06/2018 23:44:28 ※ 編輯: bill00202000 (39.12.100.42), 02/06/2018 23:45:44
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02/07 00:40, 6年前 , 12F
稍微降低ACN濃度或是流速
02/07 00:40, 12F
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02/07 00:46, 6年前 , 13F
也可以考慮減少進樣量(稀釋樣品濃度)
02/07 00:46, 13F
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02/08 00:36, 6年前 , 14F
還有column溫度可以改變看看
02/08 00:36, 14F
推
02/08 20:32, 6年前 , 15F
如果真的有兩根peak 8/9分 但 重疊 就打稀一點的sample
02/08 20:32, 15F
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02/08 20:32, 6年前 , 16F
吧。
02/08 20:32, 16F
推
02/09 02:21, 6年前 , 17F
NH2管柱分析糖的控溫有希望分開
02/09 02:21, 17F
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02/09 02:22, 6年前 , 18F
不過好像要高溫
02/09 02:22, 18F
推
02/09 19:10, 6年前 , 19F
減少inj. Volumn不是解決方法 可從mp 流速 溫度下手
02/09 19:10, 19F
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02/09 19:10, 6年前 , 20F
比較實際
02/09 19:10, 20F
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02/09 19:12, 6年前 , 21F
不同品牌的column與長度也會有差異 即便相同規格與長
02/09 19:12, 21F
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02/09 19:12, 6年前 , 22F
度 不同牌都可能不一樣
02/09 19:12, 22F
謝謝樓上的各位解答 管柱溫度目前一直採用50度， 而流速部分已有嘗試，降至0.5ml/min，對於peak低農度的標準品可分開，會在嘗試各位 提供的建議，感謝萬分 先在此祝大家新年快樂，狗年好運旺旺來 ※ 編輯: bill00202000 (39.10.36.206), 02/12/2018 19:06:33
推
02/13 13:29, 6年前 , 23F
依照原廠分析條件應該是不需要用到50度
02/13 13:29, 23F
推
03/10 12:58, 6年前 , 24F
買一隻糖柱 用90度打
03/10 12:58, 24F
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03/10 13:08, 6年前 , 25F
(離子交換柱)
03/10 13:08, 25F
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