[實驗] HPLC分離天然物分不開

看板Chemistry作者 (吱吱)時間11年前 (2013/02/04 16:55), 編輯推噓7(7推 0噓 42→)
留言49則, 5人參與, 最新討論串1/1
實驗室是做中草藥的生物活性、有效成分分離、鑑定， 最近，跑Sephadex LH20(化學修飾多糖膠體)收到一個生物活性還蠻不錯的區分， 老闆跟我討論之後，先試試HPLC分離，結果我的sample大部分一下子就跑出來了 (先說我的M.B 是 甲醇跟水，使用DAD detector，分析型管柱250x4.6) 後來試出來，比較ok的條件是，25%甲醇等梯度跑出來的結果，如下圖 http://i.imgur.com/jv0lrPq.jpg
圖中約5min那根很sharp的peak一直分不開，而且很快就跑出來了，不管我的條件怎麼變， 甚至以100%水下去跑，一樣分不開，而且滯留時間也大都在5~6min鐘跑出來， 我確定過那跟並不是solven peak! 本來還以為是什麼高極性的化合物，改用HILIC column下去打，照舊5~6min就跑出來了~ 不知道各位先進，是否有處理過類似滯留時間很短的樣品? p.s 因為後面要轉到半製備型column，要收peak做結構鑑定，故不用鹽類mobile phase去跑 -- ☆◢∵█◣ 啊！肥皂！◢███◣ ◥◣啊～學長～ ███ ≡ ███ ▁ ▁◥∴ˊ ◤◥███ ◥◣█／█◣ ███＝ ███ ████ + ★████ ◥◣██∵▄███ ≡ ███ ◥ ██◤ ██◥██ ◥◣█◤ ██） ███ ︵ ◢)█(◣ ◥ ███◤ ◥◣ ◢█／◤ ＝ ◢█ ）█ ◥█████ ◢███◣ ◥◣██▏≡ ◢█◤█◤ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.120.104.161
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02/04 17:37, , 1F
C18應該不適合用全水相去跑吧
02/04 17:37, 1F
老闆建議的，長時間確實不適合 ※ 編輯: TW185930 來自: 140.120.104.161 (02/04 17:46)
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02/04 19:59, , 2F
HILIC column時 MB是什麼?
02/04 19:59, 2F
ACN/H2O 從95%->50% 分不太好， 另外有板友建議用ACN/MeOH跑HILIC 不過就算那一坨很快出來的peak能分比較好一點，到時候我轉RP18的製 備型管柱也是沒用Orz ※ 編輯: TW185930 來自: 140.120.104.161 (02/04 20:44)
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02/04 20:56, , 3F
ACN 95% H2O 5% --> ACN 50% H2O 50% ?
02/04 20:56, 3F
對! 那時候快速測了幾個條件，總而言之分不太開! ※ 編輯: TW185930 來自: 140.120.104.161 (02/04 21:38)
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02/04 21:48, , 4F
c18這麼早出來 表示是極性樣品
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02/04 21:49, , 5F
那陀東西分不開　應該也是極性的化合物
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02/04 21:50, , 6F
所以應該不要執卓RP才對　應該只能走NP或HILIC
02/04 21:50, 6F
可是照理講 HILIC 那陀東西應該要分的開 可是 好像也不是很好， 另外，到時候要收peak，是用C18 半製備型管柱，實驗室裡沒正向半製備管柱Orz 好難搞~ ※ 編輯: TW185930 來自: 140.120.104.161 (02/04 21:56)
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02/04 21:52, , 7F
加長NP,HILIC nonpolar　MB的時間和減緩梯度變化
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02/04 21:52, , 8F
或是換一支更polar的column
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02/04 21:53, , 9F
不然看你能不能在多做幾回partition　減少雜質干擾了
02/04 21:53, 9F
partition 我有想過，前幾天找到一篇paper也是利用HSCCC(類似partition原理)將 peak分開一點! 只能在跟老師討論看看，先走一步算一步
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02/04 21:58, , 10F
然後你掃一下全光譜 看那peak有沒有更好的波長可用
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02/04 21:59, , 11F
因為ACN MeOH在210nm的干擾都比較大
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掃過了 囧 210波長吸收度最大 上面那張圖是MeOH去跑，210好像已經到MeOH的cut-off值
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02/04 22:01, , 12F
HILIC column也有很多種 不是拿來用就一定可以分得開
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了解!
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02/04 22:02, , 13F
你的東西就是很近, 所以你的條件在剛開始nonpolar就要慢
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02/04 22:02, , 14F
不能變的太快
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※ 編輯: TW185930 來自: 140.120.104.161 (02/04 22:04)
推
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0.5 mL/min流速, 250x4.6的C18 column, 五分鐘那坨
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02/05 00:11, , 16F
基本上就是flow through, 東西幾乎沒被column抓住..
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02/05 00:12, , 17F
所以收peak，是用C18 semi-prepare的column理論上沒有
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02/05 00:13, , 18F
什麼分離效果..如果還是要收peak的話, 如果分析時column
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02/05 00:16, , 19F
溫度設低(10~15度C), 雖然peak tailing 會嚴重, 但可以
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02/05 00:17, , 20F
增加在column內滯留的機會..不然分析時用150x3 um的分析
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02/05 00:18, , 21F
column試試..(不過如果連HILIC都抓不住..難道是分子量)
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02/05 00:21, , 22F
很小又極性很大?? 或是可以考慮SAX/SCX來分極性物質
02/05 00:21, 22F
老闆連買兩支c18製備行管柱qq，他把c18當作神啊!!
推
02/05 20:02, , 23F
水項加有機酸 謝謝 我跟你的題目像到一個極致XD
02/05 20:02, 23F
推
02/05 20:06, , 24F
試試看吧 並不是每個人都有用的 要注意 column的耐酸度y
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後來條件有加啊! 2%醋酸甲醇/2%醋酸水跑hilic 也沒什麼跑開 囧~ 不過hilic 我只是大致試一下，因為太多人要用 == ※ 編輯: TW185930 來自: 140.120.104.161 (02/05 20:43)
推
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有跑過C18嗎? 有用過甲酸或TFA嗎?
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02/05 21:10, , 26F
我想要問HILIC column 跟一般的C18 column有甚麼不同??
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都是酸 到底插在哪@@? 只要降pH就ok了吧@@? HILIC column 主要是以 有機相+水 下去跑，水會吸附在填充物上， 也就是類似partition方式來分離高極性物質 原理看這張圖 你應該就瞭了http://ppt.cc/43UC ※ 編輯: TW185930 來自: 140.120.104.161 (02/05 21:49)
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02/05 22:01, , 27F
這就是 try & error 喔喔 我了解了~ 因為我有自己的一套說法
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但...我老闆不承認阿QAQ
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所以我就沒講出來 差在哪 ((怕各位大大見笑 羞
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02/05 22:11, , 30F
對了 你有試著點過 TLC嗎? 看看正項的條件是否能分開
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02/05 22:11, , 31F
若能分開 看看能不能架一隻 Open Column 這樣我覺得比較快速
02/05 22:11, 31F
我另外一個同學，跟我有類似情況 有去點tlc 結果分不開 一大堆卡在原點== 我也想做一下tlc，等這禮拜有時間跟老師討論一下~ 我這個中草藥是跑了Amberlite(一種大顆粒膠體)一次， 收下來有活性的區分再去跑Sephadex，再從有效的區分拿去打HPLC，結果就遇到上述狀況 ，你也知道的~東西會越收越少QQ，我怕sample不夠跑矽膠管柱QQ ※ 編輯: TW185930 來自: 114.46.210.38 (02/05 22:39)
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02/05 23:00, , 32F
真的QAQ 不過我先問一下 你LH-20是用open column去分??
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也是用逆項條件? 水&MeOH?
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對!open column去收區分，用XK column+蠕動pump 我是用甲醇/水拉梯度 大概分成 4個階段 0~40%、50~65%、65~80%及100% MeOH ※ 編輯: TW185930 來自: 114.46.210.38 (02/05 23:18)
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02/05 23:22, , 34F
喔喔 了解了!! 加油啊~我知道做這條路的艱辛QAQ ((拍肩
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02/05 23:23, , 35F
祝你分出New compound :D
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嗚嗚 我不要分出什麼新康胖，到時候結構解不出來，畢不了業怎麼辦 ※ 編輯: TW185930 來自: 114.46.210.38 (02/05 23:24)
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02/05 23:41, , 36F
哈哈新康胖不好嗎? 可遇不可求耶XD 交給你們老闆看有無辦法XD
02/05 23:41, 36F
推
02/06 00:47, , 37F
看到加酸跟天然物萃取突然想到..MP加酸目的是使目標物的
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02/06 00:48, , 38F
的charge能不易受pH改變而改變..TFA跟醋酸很常用..mass
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上也不會影響..我要說的是想到通常天然物的compound含氮
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的function group不少..所以在中性或酸性的MP時，
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compound的極性還是會很大，使得不易停留在C18 column中
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02/06 00:53, , 42F
可使用有end-capping以及modified的C18(也就是能用於高)
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02/06 00:54, , 43F
pH的column; 各大廠都有..應該都還可以到pH10~12...
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02/06 00:55, , 44F
如此可以改善peak tailing跟RT很早就出來~~
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02/06 00:58, , 45F
原來是這個原因 ((筆記中
02/06 00:58, 45F
推
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至於MP的選擇..mass能用得不多...氨水可以試試...
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02/06 01:18, , 47F
如果抽乾solvent 再單打mass呢?
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02/06 16:37, , 48F
不過 TFA卡在我們MS超久= ="
02/06 16:37, 48F
tfa用濃縮方法趕走， 要蠻久的，需要一直+MeOH，直到pH升高穩定 ※ 編輯: TW185930 來自: 140.120.104.161 (02/06 17:57)
推
02/23 16:50, , 49F
你同學點TLC的條件是什麼?
02/23 16:50, 49F
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