[實驗]HPLC mobile phase的peak

看板Chemistry作者 (さとし)時間11年前 (2013/01/22 23:54), 編輯推噓6(6推 0噓 16→)
留言22則, 4人參與, 最新討論串1/1
最近在使用HPLC分析高分子聚合物(polypeptide) 第一次使用HPLC，想請教一個問題 我的column是size exclusion chromatography mobile phase是PBS detector是用RI 在進樣前已經有將base line歸零穩定了 然而我的sample進樣後，RT在10分、15分與18分時都會出現peak 打一針空針(only mobile phase)，peak只在15、18分鐘出現 可想而知我的sample應該是在10分鐘出現的那個peak 我的問題是，為什麼15、18分鐘時，會出現訊號呢? 其他人好像都說因為mobile phase本身也會有訊號 但我在進樣前已經將訊號穩定，訊號呈現水平，mobile phase是一樣的 沒道理再打一針mobile phase就會在15、18分鐘出現訊號 打一針純水也會出現一樣的訊號.... 但是換了mobile phase後，訊號就不同了 想請問一下，這是什麼原因呢?? 謝謝 -- ┌── ◢█""◣ ─┐┌─── ◤"" "◥─┐┌── ◢██◣ ─┐ ╔═════＠│船 ▂▂▂▂▂▂ ││戰 ◤◥ ││廚 ◤◥██ │ ║ ONEPIECE ║│長 ◤●◥●◥ ││鬥 ▂◥█◤▂ ││師香 ● ◥◥ ζ│ ║草帽海賊團║│ 魯◣ ▼ "◢ ││員索 ╲◣ 冊─◢╱││ 吉 ◣ ３ ◢▁▁│ ＠═════╝│ 夫 < ： ── ││ 隆 ㄟ/██\℅ ││ 士 <|:￥:|╯ │ ψyang0515 └── ▃▃ ─┘└──── ▃▃ ─┘└── | ▂ | ─┘ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.138.155.68
推
01/23 03:15, , 1F
run的mobile phase(MP)跟打進去的MP是同一時間配的嗎?
01/23 03:15, 1F
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01/23 03:16, , 2F
如果是的話..會不會是sample loop (手動的話是多向閥)
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那邊會不會髒掉了?
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01/23 03:17, , 4F
不過確實SEC的column的solvent front有時候會有訊號~~
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01/23 03:18, , 5F
所以你15/18分鐘會有peak..不過通常peak shape 會不好!
01/23 03:18, 5F
打mobile phase是直接從mobile phase取出後直接進樣，同一瓶MP 我進樣是用自動式的，機器會自己洗針 本來也是推測smaple loop髒掉，但是換成不同MP訊號就不同了 所以應該不是污染的問題?! 不同的MP，偵測器(RI)穩定後 打出來也有不同的訊號 peak shape看起來也像一般樣品一樣，高峰狀的@@ 所以才想問問看用RI偵測，是不是每次都要先打一針MP，比較peak後才能知道sample 的RT在哪? 謝謝 :) ※ 編輯: Peetu 來自: 140.138.155.68 (01/23 03:41)
推
01/23 08:00, , 6F
我用的兩台DMF跟THF eluent也都會有MP的峰
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就算直接拿MP注入 還是會有但明顯小很多
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01/23 08:03, , 8F
跟technician討論的結果是 當sample loop進樣時會有一小
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段的eluent因為轉動某種原因造成不一樣... 那隻peak不
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管怎麼樣都會出現 雖然這結論有點牽強...
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你也可以試試把loop purge後直接轉動loop 我的結果還是
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會有訊號
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sample loop在進樣前應該也是充滿了MP，但進様後sample與前端一些MP，一起推入 進去size exclusion column，理論上那些殘餘的MP應該會快速隨著後來的MP流出column 且應該不會有任何(背景)訊號才對?! 因為之前在做FPLC時，打一針MP空針確實是沒有任何訊號的 (用UV) 想說基本原理應該是大致相同 但看了其他人做HPLC實驗，打一針MP好像是要確認MP的peak會落在哪?! 然後當control組 在與sample組做比較 只是還是有點不解 為什麼MP會在固定的RT上出現peak.... 雖然我現在HPLC是用RI偵測，但看朋友用UV的，打醇類MP好像也會很多peak... 之前有跟老師討論好像也沒什麼結果 @@ 不知道還有沒有其他想法 謝謝回答 :) ※ 編輯: Peetu 來自: 114.43.51.61 (01/23 09:30)
推
01/23 11:49, , 13F
那是新column嗎? MP是等梯度? 有打三次 都一樣?
01/23 11:49, 13F
推
01/23 15:45, , 14F
什麼樣的梯度?
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01/23 22:04, , 15F
我的UV跟RI都會有訊號 但就只有一支 但不影響我的分析
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所以就不管它了
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推
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SEC是靠分子量.所以在固定RT會出來...還有RI對溫度
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01/24 02:46, , 18F
的改變也算靈敏..不過你是從MP取出後再打..應該也沒差
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01/24 02:49, , 19F
一般Water or Agilent的LC autosampler 洗針是只有洗針
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推
01/24 02:51, , 20F
的外表..針的內部要用其他程式或多洗幾次才會乾淨..
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既然autosampler沒問題的話...就只剩下vial及vial的墊片
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內的東西被MP溶掉後打進去了..雖然這可能性很小...
01/24 02:53, 22F
我的MP並沒有拉梯度，已經打過超過三次了，peak都一樣 column 一支新的 一隻是舊的 (串聯使用)，舊的單跑是有peak，新的沒有單跑過 所以不確定是否會出現相同的peak，串聯後與單跑的peak差不多，只是RT有延後 S版友的意思是可能汙染嗎? Vial跟墊片有重複使用，但LAB其他人使用好像就沒這些狀況 column和RI都有恆溫系統在控制， 最近有查一下HPLC的資料，用UV時，選擇solven需要考慮uv cut off的問題，不知道 用RI是否也有需要注意的細節呢? SEC是靠分子量去分，RT是會在相同地方出來沒錯， 但我的問題是 如果是MP會造成背景值的問題，應該不會在固定的地方有相同強度的訊號?! 謝謝 ※ 編輯: Peetu 來自: 140.138.155.68 (01/24 23:47) ※ 編輯: Peetu 來自: 140.138.155.68 (01/24 23:53)
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